بررسي و تعيين الگوي مقاومت آنتي بيوتيکي Acinetobacter baumannii جدا شده از بيماران بستري در بيمارستان هاي تهران به روش PCR
محورهای موضوعی : مقاومت آنتی بیوتیکی
پریسا مجدیان فر
1
(گروه ميکروبيولوژي، دانشکده علوم و فناوري هاي نوين، علوم پزشکي تهران، دانشگاه آزاد اسلامي، تهران، ايران)
ستاره حقیقت
2
(عضوهیئت علمی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم پزشکی تهران)
فرشاد هاشمیان
3
(ستاد، گروه داروسازی بالینی، دانشکده داروسازی، علوم پزشکی تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران)
بهاره نوروزی
4
(گروه زيست شناسي، دانشکده علوم پايه، علوم تحقيقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامي، تهران، ايران)
کلید واژه: Acinetobacter baumannii, مقاومت به آنتي‌بيوتيک, آنتيبيوگرام, PCR,
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: باکتري Acinetobacter baumannii يک پاتوژن فرصت طلب است که مسئول طيف وسيعي از عفونت‌هاي بيمارستاني است. اين باکتري‌ها عوامل مختلفي را براي مقاومت در برابر آنتي‌بيوتيک‌هاي مختلف از جمله مقاومت در برابر بتالاکتامها، آمينوگليکوزيدها و تتراسايکلينها دارند. هدف از اين مطالعه تعيين الگوي حساسيت ضد ميکروبي و شيوع ژنهاي blaIMP4، blaCTX-M ،tetA و aadB در سويه‌هاي A. baumannii به‌دست‌آمده از بيمارستان‌هاي امام خميني، بهمن، بوعلي و امير المومنين بود. مواد و روش ها: در اين مطالعه مقطعي، 100 ايزوله باليني Acinetobacter baumannii از بيمارستان‌هاي مختلف تهران جمع‌آوري شد. پس از شناسايي جدايههاي Acinetobacter baumannii توسط آزمون هاي بيوشيميايي، آزمايش حساسيت به آنتي‌بيوتيک (روش کربي-بائر) طبق توصيه CLSI 2021 در برابر 8 آنتي‌بيوتيک انجام شد. سرانجام، ژنهاي blaIMP4، blaCTX-M ،tetA و aadB در ميان جدايههاي مقاوم به آنتي‌بيوتيک با استفاده از PCR تعيين شدند. يافته ها: بر اساس نتايج انتشار ديسک،ميزان مقاومت 90% براي سيپروفلوکساسين، 32% سفتازيديم، 25% ايميپنم، 36% جنتامايسين، 34% استرپتومايسين، 28% پيپراسيلين، 5% پليميکسين B و 63% تتراسايکلين را نشان داد. همه جدايهها به کوليستين حساس بودند. PCR ژنهاي blaIMP4، blaCTX-M،tetA و aadB به ترتيب در 63%، 62%، 76% و 71% از ايزوله‌هاي مقاوم شناسايي شد. نتيجه گيري: بطورکلي در اين مطالعه جدايههاي باليني A. baumannii داراي ژنهاي مقاومت به آنتي‌بيوتيک، شناسايي شد، شناسايي الگوهاي مقاومت به آنتي‌بيوتيک در A. baumannii و بررسي اپيدميولوژي مولکولي براي کنترل گسترش سريع سويه‌هاي مقاوم بسيار مهم است.
Aim and Background: Acinetobacter baumannii is an opportunistic bacterial pathogen responsible for a wide range of hospital-acquired infections. These bacteria take a variety of factors for resistance to different antibiotics, including resistance to β-lactams, aminoglycosides, and tetracyclines. The aims of this study were to determine the antimicrobial susceptibility pattern and prevalence of bla IMP4, bla CTX-M, tetA, and aadB genes in A. baumannii strains obtained from Imam Khomeini, Bahman, Bu-Ali, and Momenin hospitals. Material and Methods: In this cross-sectional study, 100 clinical Acinetobacter baumannii isolates were collected from various hospitals in Tehran. After the identification of Acinetobacter baumannii isolates by biochemical tests, the antibiotic susceptibility test (Kirby-Bauer method) was done according to CLSI 2021 advice against 8 antibiotics. Finally, the bla IMP4, bla CTX-M, tetA, and aadB genes were determined among the antibiotic-resistant isolates using PCR. Results: According to results, the disc diffusion results showed resistance rates of 90% for ciprofloxacin, 32% ceftazidime, 25% imipenem, 36% gentamicin, 34% streptomycin, 28% piperacillin, 5% polymyxin B and 63% tetracyclin. All isolates were susceptible to colistin. PCR results for bla IMP4, bla CTX-M, tetA, and aadB genes were detected in 63%, 62%, 76%, and 71% of resistant isolates respectively. Conclusion: This study detected clinical A. baumannii isolates harboring antibiotic resistance genes. Identification of antibiotic resistance patterns in A. baumannii and investigation of molecular epidemiology is critical to controlling the rapid spread of antimicrobial-resistant strains.
1. Nguyen M, Joshi S. Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii, and their importance in hospital‐acquired infections: a scientific review. Journal of applied microbiology. 2021;131(6):2715-38.
2. López M, Blasco L, Gato E, Perez A, Fernández-Garcia L, Martínez-Martinez L, et al. Response to bile salts in clinical strains of Acinetobacter baumannii lacking the AdeABC efflux pump: virulence associated with quorum sensing. Frontiers in cellular and infection microbiology. 2017;7:143.
3. Wong D, Nielsen TB, Bonomo RA, Pantapalangkoor P, Luna B, Spellberg B. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical microbiology reviews. 2017;30(1):409-47.
4. Viehman JA, Nguyen MH. Treatment options for carbapenem-resistant and extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii infections. Drugs. 2014;74(12):1315-33.
5. Poirel L, Bonnin RA, Nordmann P. Genetic basis of antibiotic resistance in pathogenic Acinetobacter species. IUBMB life. 2011;63(12):1061-7.
6. Li F-J, Starrs L, Burgio G. Tug of war between Acinetobacter baumannii and host immune responses. Pathogens and disease. 2018;76(9):ftz004.
7. Yusuf I, Skiebe E, Wilharm G. Evaluation of CHROMagar Acinetobacter and MacConkey media for the recovery of Acinetobacter baumannii from soil samples. Letters in Applied Microbiology. 2023;76(2):ovac051.
8. Medioli F, Bacca E, Faltoni M, Burastero GJ, Volpi S, Menozzi M, et al. Is it possible to eradicate carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii (CRAB) from endemic hospitals? Antibiotics. 2022;11(8):1015.
9. Chang Y, Luan G, Xu Y, Wang Y, Shen M, Zhang C, et al. Characterization of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolates in a Chinese teaching hospital. Frontiers in microbiology. 2015;6:910.
10. Liu Y, Liu X. Detection of AmpC β-lactamases in Acinetobacter baumannii in the Xuzhou region and analysis of drug resistance. Experimental and therapeutic medicine. 2015;10(3):933-6.
11. Aksoy MD, Çavuşlu Ş, Tuğrul HM. Investigation of metallo beta lactamases and oxacilinases in carbapenem resistant Acinetobacter baumannii strains isolated from inpatients. Balkan medical journal. 2015;32(1):79-83.
12. Shoja S, Moosavian M, Rostami S, Abbasi F, Tabatabaiefar MA, Peymani A. Characterization of oxacillinase and metallo-β-lactamas genes and molecular typing of clinical isolates of Acinetobacter baumannii in Ahvaz, South-West of Iran. Jundishapur journal of microbiology. 2016;9(5).
13. Khosroshahi SA, Farajnia S, Azhari F, Hosseini MK, Khanipour F, Farajnia H, et al. Antimicrobial Susceptibility Pattern and Prevalence of Extended-Spectrum β-Lactamase Genotypes among Clinical Isolates of Acinetobacter baumanii in Tabriz, North-West of Iran. Jundishapur Journal of Microbiology. 2017;10(6).
14. Hashemizadeh Z, Emami A, Rahimi M. Acinetobacter antibiotic resistance and frequency of ESBL-producing strains in ICU patients of Namazi Hospital (2008-2009). Journal of Inflammatory Diseases. 2010;14(2):47-53.
15. Peymani A, Nahaei M-R, Farajnia S, Hasani A, Mirsalehian A, Sohrabi N, et al. High prevalence of metallo-β-lactamase-producing Acinetobacter baumannii in a teaching hospital in Tabriz, Iran. Japanese journal of infectious diseases. 2011;64(1):69-71.
16. Sharif M. Molecular identification of TEM and SHV extended spectrum beta -lactamase in clinical isolates of Acinetobacter baumannii from Tehran hospitals. 2014.
فصلنامه دانش ميکروب شناسي
بررسي و تعيين الگوي مقاومت آنتي بيوتيکي.../ مجدیان فر و همکاران
Investigating and determining the antibiotic resistance pattern of Acinetobacter baumannii isolated from patients hospitalized in Tehran hospitals by PCR
Parisa Majdianfar1, Setareh Haghighat1*, Farshad Hashemian2, Bahareh Nowruzi3
1- Department of Microbiology, Faculty of Advanced Science and Technology, Tehran Medical Sciences, Islamic Azad University, Tehran, Iran, setareh_haghighat@yahoo.com
2- Department of Clinical Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Tehran Medical Sciences, Islamic Azad University, Tehran, Iran
3- Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
Abstract
Aim and Background: Acinetobacter baumannii is an opportunistic bacterial pathogen responsible for a wide range of hospital-acquired infections. These bacteria take a variety of factors for resistance to different antibiotics, including resistance to β-lactams, aminoglycosides, and tetracyclines. The aims of this study were to determine the antimicrobial susceptibility pattern and prevalence of bla IMP4, bla CTX-M, tetA, and aadB genes in A. baumannii strains obtained from Imam Khomeini, Bahman, Bu-Ali, and Momenin hospitals.
Material and Methods: In this cross-sectional study, 100 clinical Acinetobacter baumannii isolates were collected from various hospitals in Tehran. After the identification of Acinetobacter baumannii isolates by biochemical tests, the antibiotic susceptibility test (Kirby-Bauer method) was done according to CLSI 2021 advice against 8 antibiotics. Finally, the bla IMP4, bla CTX-M, tetA, and aadB genes were determined among the antibiotic-resistant isolates using PCR.
Results: According to results, the disc diffusion results showed resistance rates of 90% for ciprofloxacin, 32% ceftazidime, 25% imipenem, 36% gentamicin, 34% streptomycin, 28% piperacillin, 5% polymyxin B and 63% tetracyclin. All isolates were susceptible to colistin. PCR results for bla IMP4, bla CTX-M, tetA, and aadB genes were detected in 63%, 62%, 76%, and 71% of resistant isolates respectively.
Conclusion: This study detected clinical A. baumannii isolates harboring antibiotic resistance genes. Identification of antibiotic resistance patterns in A. baumannii and investigation of molecular epidemiology is critical to controlling the rapid spread of antimicrobial-resistant strains.
Keywords: Acinetobacter baumannii, Antibiotic resistance, Antibiogram, PCR
بررسي و تعيين الگوي مقاومت آنتي بيوتيکي Acinetobacter baumannii جدا شده از بيماران بستري در بيمارستان هاي تهران به روش PCR
پريسا مجديان فر1، ستاره حقيقت*1، فرشاد هاشميان2، بهاره نوروزي3
1. گروه ميکروبيولوژي، دانشکده علوم و فناوري هاي نوين، علوم پزشکي تهران، دانشگاه آزاد اسلامي، تهران، ايران
2. گروه داروسازي باليني، دانشکده داروسازي، علوم پزشکي تهران، دانشگاه آزاد اسلامي، تهران، ايران
3. گروه زيست شناسي، دانشکده علوم پايه، علوم تحقيقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامي، تهران، ايران
چکيده
سابقه و هدف: باکتري Acinetobacter baumannii يک پاتوژن فرصت طلب است که مسئول طيف وسيعي از عفونت‌هاي بيمارستاني است. اين باکتري‌ها عوامل مختلفي را براي مقاومت در برابر آنتي‌بيوتيک‌هاي مختلف از جمله مقاومت در برابر بتالاکتامها، آمينوگليکوزيدها و تتراسايکلينها دارند. هدف از اين مطالعه تعيين الگوي حساسيت ضد ميکروبي و شيوع ژنهاي blaIMP4، blaCTX-M ،tetA و aadB در سويه‌هاي A. baumannii به‌دست‌آمده از بيمارستان‌هاي امام خميني، بهمن، بوعلي و امير المومنين بود.
مواد و روشها: در اين مطالعه مقطعي، 100 ايزوله باليني Acinetobacter baumannii از بيمارستان‌هاي مختلف تهران جمع‌آوري شد. پس از شناسايي جدايههاي Acinetobacter baumannii توسط آزمون هاي بيوشيميايي، آزمايش حساسيت به آنتي‌بيوتيک (روش کربي-بائر) طبق توصيه CLSI 2021 در برابر 8 آنتي‌بيوتيک انجام شد. سرانجام، ژنهاي blaIMP4، blaCTX-M ،tetA و aadB در ميان جدايههاي مقاوم به آنتي‌بيوتيک با استفاده از PCR تعيين شدند.
يافتهها: بر اساس نتايج انتشار ديسک،ميزان مقاومت 90% براي سيپروفلوکساسين، 32% سفتازيديم، 25% ايميپنم، 36% جنتامايسين، 34% استرپتومايسين، 28% پيپراسيلين، 5% پليميکسين B و 63% تتراسايکلين را نشان داد. همه جدايهها به کوليستين حساس بودند. PCR ژنهاي blaIMP4، blaCTX-M،tetA و aadB به ترتيب در 63%، 62%، 76% و 71% از ايزوله‌هاي مقاوم شناسايي شد.
نتيجهگيري: بطورکلي در اين مطالعه جدايههاي باليني A. baumannii داراي ژنهاي مقاومت به آنتي‌بيوتيک، شناسايي شد، شناسايي الگوهاي مقاومت به آنتي‌بيوتيک در A. baumannii و بررسي اپيدميولوژي مولکولي براي کنترل گسترش سريع سويه‌هاي مقاوم بسيار مهم است.
واژههاي کليدي:Acinetobacter baumannii، مقاومت به آنتي‌بيوتيک، آنتيبيوگرام، PCR
_____________________________________________________________________________________
مقدمه
اسينتوباکتربوماني (Acinetobacter baumannii) يکي از مهم‌ترين گونه‌هاي باکتري گرم منفي در ارتباط با عفونت بيمارستاني ازجمله پنوموني در ارتباط با ونتيلاتورها، باکتريمي، عفونت هاي مجاري ادراري، عفونت‌هاي زخم، پوست و مننژيت ميباشد(1). طي دهه‌هاي گذشته اين باکتري به اغلب آنتي‌بيوتيک‌ها ازجمله سفالوسپورين هاي وسيع الطيف، پني‌سيلين‌ها، کارباپنم ها، فلوروکينون ها و آمينوگليکوزيدها مقاوم شده است (2). چندين مکانيسم مختلف در ايجاد فنوتيپ مقاوم به چند دارو در Acinetobacter baumannii نقش دارند از جمله کاهش نفوذپذيري پروتئين غشاي خارجي يا OMP، از دست دادن ژنهاي کد کننده پورين‌ها، توليد آنزيم‌هاي تخريب‌کننده داروها مانند بتالاکتامازها، بيان بيش از حد پمپ‌هاي تراوشي که درنتيجه جهش ژني تعداد اين‌گونه پمپ‌ها افزايش پيداکرده است، همچنين کسب عوامل ژنتيکي حمل‌کننده عوامل ايجاد مقاومت ازجمله پلاسميدها، اينتگرون ها، ترانسپوزون ها و جزاير مقاومت ازجمله اين مکانيسم‌ها هستند (3). به‌واسطه ايجاد مقاومت‌هاي آنتي‌بيوتيکي در اين باکتري، مشکلات فراواني در درمان موفقيت‌آميز بيماران و در پي آن مرگ‌ومير ايجادشده است. انعطاف‌پذيري ژني Acinetobacter baumannii اجازه مي‌دهد تا انباشت وسيعي از عوامل تعيين‌کننده مقاومت در اين باکتري ايجاد شود. يکي از آنتي‌بيوتيک‌هايي که اين باکتري بسيار به آن مقاوم شده است آنتي‌بيوتيک کارباپنم ميباشد که علت ايجاد اين مقاومت مکانيسم بيوشيميايي
ميباشد که آنزيم بتالاکتاماز در آن دخيل است. قرار گرفتن پروموتر ژن ISAbal متعلق به خانواده IS4 در بالادست
*آدرس نویسنده مسئول: گروه میکروبیولوژی، دانشکده زیستی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال
پست الکترونیک: setareh_haghighat@yahoo.com
تاریخ دریافت مقاله: 10/09/1401
تاریخ پذیرش: 14/2/1402
ژن blaampC باعث افزايش بيان ژن آنزيم بتالاکتامازشده است(4). طيف گسترده‌اي از Ampc (ESAC) در بتالاکتاماز شناسايي‌شده است. همچنين Acinetobacter baumannii فعاليت مقاومتي بسيار قوي را عليه سفالوسپورين ها و مونو باکتام ها به‌وسيله جايگزيني ژن pro210Arg و دوبل کردن Ala در موقعيت 215 لوپ امگا از خود نشان مي‌دهد(5). اسينتوباکتربوماني يک ژن ديگر به نام OXA-51 را نيز براي بتالاکتاماز کد مي‌کند که واريانت هاي جهشي بسياري نيز براي آن گزارش‌شده است. يک رويکرد و تکنيک مناسب مولکولي و تشخيصي مقايسه‌اي در رابطه با ژن Acinetobacter baumannii مي‌تواند ژنهاي مقاومت دارويي Acinetobacter baumannii را به‌درستي رديابي و شناسايي کند. روش مولکولي PCR براي بررسي ژنهاي مقاومت دارويي در اسينتوباکتربوماني و توالي يابي اين ژن‌ها براي شناسايي جامع الگوي مقاومت دارويي Acinetobacter baumannii روش مناسبي ميباشد (6). از اين رو هدف اين تحقيق بررسي و تعيين الگوي مقاومت آنتي‌بيوتيکي Acinetobacter baumannii جداشده از بيماران بستري در بيمارستان‌هاي آموزشي دانشگاه آزاد در تهران به روش PCR و شناسايي الگوي مقاومت دارويي براي ساخت آنتي‌بيوتيک‌هاي جديد بود.
مواد و روشها
كشت و جداسازي باکتري‌ها: ابتدا تعداد 120 نمونه Acinetobacter baumannii از بيماران بستري‌شده از بيماران مراجعهکننده به بيمارستان‌هاي امام خميني، بهمن، بوعلي و اميرالمؤمنين در تهران جمع آوري شده جهت خالص‌سازي و صحت هويت اين نمونه‌ها، باکتري‌ها روي محيط کشت استريل EMB و مک کانکي آگار کشت داده‌شده و سپس تأييد نهايي شدند. پس از تأييد، تعداد 100 نمونه مشکوك به جنس Acinetobacter شناسايي شدند، آزمون حساسيت آنتي‌بيوتيکي به روش ديسک ديفيوژن براي هر سويه انجام شد.
ديسک‌هاي آنتي‌بيوتيکي: ديسک‌هاي آنتي‌بيوتيکي شامل ايمي پنم، سيپروفلوكساسين، جنتامايسين، تتراسايكلين، سفتازيديم، پيپراسيلين، استرپتومايسين و پلي ميکسين از شرکت Bioanalyse Turkey خريداري و طبق دستور العمل شرکت در يخچال و دماي c˚4 نگهداري شدند.
تهيه استاندارد نيم مک فارلند: استاندارد نيم مک فارلند يک سوسپانسيون حاصل از مخلوط کردن ml 5/0 (mol/ml 048/0) باريم کلريد1 آبدار يک درصد و ml 99/5 (mol/ml18/0) اسيدسولفوريک2 يک درصد است، کدورت اين سوسپانسيون معادل 108 × 5/1 باکتري در ميلي‌ليتر است. جذب يک سوسپانسيون معادل نيم مک فارلند در طول موج nm 625 در محدوده 08/0- 13/0 قرار دارد.
آزمون آنتي بيوگرام: براي انجام آنتي بيوگرام، ابتدا سوسپانسيوني از کشت خـالص باکتري‌هاي مـورد آزمـايش بـا كدورت معادل نيم مك فارلند تهيه شد. براي استانداردسازي دانسيته تلقيح باکتري، از کدورت مطابق با استاندارد نيم مک فارلند استفاده شد و با هم زدن مداوم يک سوسپانسيون همگن تهيه گرديد. چگالي صحيح استاندارد با تعيين جذب اين سوسپانسيون که توسط دستگاه نانودراپ در طول موج nm 625 سنجيده شد، بين 08/0 تا 13/0 گزارش شد. بـلافاصـله بعد از ساخت استاندارد نيم مک فارلند نمونه‌ها پس از مقايسه با استاندارد تهيه و به‌وسيله سـواپ اسـتريل بـر روي محـيط مولر هينتون آگـار كشـت چمني داده شـدند، سـپس در فاصـله كمتـر از 15 دقيقـه، ديسک‌هاي آنتي‌بيوتيکي شامل ايمي پنم، سيپروفلوكساسين، جنتامايسين، تتراسايكلين، سفتازيديم، پيپراسيلين، استرپتومايسين و پلي ميکسين با فواصل منظم، بر روي محيط مولر هينتون آگار استريلي که از قبل تهيه‌شده بود، قرار داده شد و در انکوباتور در دماي 37 درجه سانتي گـراد به مدت 18 الي 24 ساعت انكوبه گرديد. بعد از تعيين الگوي مقاومت آنتي‌بيوتيکي و شناسايي انواع مقاوم، حضور و عدم حضور ژنهاي موردنظر در اين مطالعه با استفاده از تکنيک واکنش زنجيرهاي پلي مراز (PCR) تأييد شد.
PCR نمونه DNA هاي استخراج شده از باکتري‌ها: قبل از انجام آزمون PCR با توجه به نياز، DNA سوش هاي باکتريايي به روش استاندارد مطابق با دستورالعمل کيت استخراج (DNA) سيناکلون استخراج شدند. جهت انجام PCR، در مرحله اول با توجه به سکانس ژن هايي که از سايت NCBI، گرفته‌شده بود توسط برنامه Gene Runner، پرايمرهاي هر ژن طراحي و بلست گرديد، توالي پرايمرهاي استفاده شده در اين تحقيق طبق جدول زير است:
[1] BaCl2
[2] H2SO4
جدول 1: توالي پرايمرهاي استفاده‌شده در روش PCR و وزن خالص محصول و دماي اتصال
دماي اتصال (°C) | وزن خالص )bp( | طول باند | توالي پرايمر | نام ژن | ||
56 | 3/56 | bp912 | 5ʹGGGACTATTCATGTTGTTGTTATTTCG3ʹ | Forward | blaCTX-M-15 | 1 |
| 5/56 | 5ʹTGACGATTTTAGCCGCCGA3ʹ | Reverse | |||
58 | 8/55 | bp1275 | 5ʹTTCAATCGGACCAGCGGAG3ʹ | Forward | tetA | 2 |
| 7/55 | 5ʹCTCGTTGCCCTGCGCC3ʹ | Reverse | |||
54 | 9/52 | bp741 | 5ʹATCTGTATTCTTTATATTTTTGTTTTGTAGC3ʹ | Forward | blaIMP4 | 3 |
| 4/53 | 5ʹTAGTTGCTTAGTTTTGATGGTTTTTTAC3ʹ | Reverse | |||
5/51 | 8/52 | bp516 | 5ʹATGAGGGAAGCGGTGATCG3ʹ | Forward | aadB | 4 |
| 7/50 | 5ʹATTTGCCGACTACCTTGGTGA3ʹ | Reverse | |||
واکنش PCR در حجم نهايي 25 ميكروليتر مخلوط واکنش (5/12 ميکرو ليتر مستر ميكس شرکت سيناکلون، 5/1 ميکرو ليتر از هر پرايمر و 5/1 ميکرو ليتر DNA باکتري و بقيه آب مقطر استريل) در طي 35 سيكل، شامل مرحله آغازي که اين مرحله براي DNA پليمرازي که نيازمند فعال‌سازي گرمايي به‌وسيله Hot-start PCR است، لازم ميباشد و شامل گرم کردن محفظه واکنش تا دماي 95 درجه سانتي گراد براي پليمراز مورد آزمايش ميباشد که اين مرحله 10 دقيقه به طول انجاميد. مرحله دناتوره شدن با دماي C◦95 در مدت زمان 5 دقيقه. مرحله اتصال که براي متصل شدن پرايمرها به نمونه مورد نياز است و براي ژنهاي موردمطالعه دماهاي متفاوتي را شامل شد که در جدول 1 آورده شده است، مرحله طويل شدن که آنزيم DNA polymerase که همانندسازي را آغاز مي‌کند با دماي C◦72 در مدت‌زمان 1 دقيقه اعمال شد، مرحله طويل شدن نهايي که در اين مرحله دماي C◦72 در مدت زمان 10 دقيقه مورد استفاده قرار گرفت. مرحله نگهداري نهايي که مرحله نهايي سرد کردن محفظه واکنش تا ۴ درجه سانتي گراد براي يک زمان نامحدود است و اين مرحله براي ذخيره‌سازي کوتاه مدت محصولات PCR استفاده شد. در نهايت نمونه‌ها بلافاصله بر روی ژل آگارز 5/1% اجرا شدند.
نتايج و بحث
اطلاعات مربوط به بيماران بستري‌شده، بخش‌هاي محل جمع‌آوري نمونه‌ها در بيمارستان و نوع نمونه بيمارستاني به ترتيب در جداول زیر(2و3) نشان داده شده است.
با توجه به اطلاعات به دست آمده، فراواني سويه‌هاي Acinetobacter baumannii در بخش ICU از همه بخش‌ها بيشتر بود.
جدول 2: فراواني سويه‌هاي Acinetobacter baumannii با توجه به بخش‌هاي بيمارستاني
تعداد کل | ارتوپدى | اعصاب مردان | دپارتمان زنان | ICU |
100 %100 | 7 %7 | 7 %7 | 9 %9 | 77 %77 |
جدول 3: فراواني سويه‌هاي Acinetobacter baumannii در نمونه‌هاي جمع‌آوري‌شده
تعداد کل | کشت مايع نخاعي | کاتتر | زخم | کشت خون | ريه | خلط | ترشحات برونش |
100 %100 | 2 %2 | 2 %2 | 40 %40 | 8 %8 | 40 %40 | 5 %5 | 3 %3 |
سويه‌هاي اسينتوباکتر، باسيل‌هاي گرم منفي هستند، که به‌خوبي بر روي MacConkey آگار بدون نمک رشد مي‌کنند. اگرچه رسماً به‌عنوان تخمير نشده لاکتوز طبقه‌بندي نشده است، اما اغلب وقتي که روي آگار MacConkey رشد مي‌کنند تا حدي جزئي تخمير لاکتوز مي‌شوند. آن‌ها اکسيداز منفي، کاتالاز مثبت، ايندول منفي، غير متحرک و معمولاً نيترات منفي هستند(7).
آزمون‌هاي بيوشيميايي تائيدي براي Acinetobacter baumannii در جدول 4 نمايش داده شده است.
جدول 4: آزمون‌هاي بيوشيميايي تائيدي براي Acinetobacter baumannii
آزمون بيوشيميايي | تخمير لاکتوز | اکسيداز | کاتالاز | ايندول | حرکت |
Acinetobacter baumannii | + | - | + | - | - |
آزمون حساسيت آنتي‌بيوتيکي (آنتي بيوگرام)
بر روي 100 نمونه Acinetobacter baumannii، به‌طور جداگانه ديسک‌هاي آنتي‌بيوتيکي قرار داده شدند. در اين مطالعه 8 آنتي‌بيوتيک مورد بررسي قرار گرفتند. ميزان مقاومت آنتي‌بيوتيکي بر اساس دستورالعمل CLSI 2021 مشخص شده است. نتايج مقاومت آنتي‌بيوتيکي در جدول 5 و شکل 2 نشان داده شده است.
جدول 5: درصد حساسيت و مقاومت نمونه‌هاي Acinetobacter baumannii به آنتي‌بيوتيک‌ها
تعداد نمونه مقاوم | تعداد نمونه نيمه حساس | تعداد نمونه حساس | نام آنتي‌بيوتيک | ||
63 | 0 | 37 | تتراسايکلين | 1 | |
90 | 6 | 4 | سيپروفلوکساسين | 2 | |
36 | 35 | 29 | جنتامايسين | 3 | |
25 | 12 | 63 | ايمي پنم | 4 | |
32 | 38 | 30 | سفتازيديم | 5 | |
28 | 72 | 0 | پيپراسيليلن | 6 | |
34 | 0 | 66 | استرپتومايسين | 7 | |
5 | 7 | 88 | پلي ميکسين | 8 | |
شکل 2- تعداد و درصد مقاومت نمونه‌هاي Acinetobacter baumannii به آنتي‌بيوتيک‌هاي مورد آزمايش
نتايج حاصل از PCR
براي بررسي ميزان شيوع ژنهاي blaIMP4، tetA و blaCTX-M و aadB نمونه‌هاي مقاوم جدا شدند. در اين مطالعه موارد زير بررسي شدند، شيوع ژن blaIMP4 در نمونه‌هاي مقاوم به ايمي پنم و پيپراسيلين و سفتازيديم 30 نمونه، شيوع ژن tetA در نمونه‌هاي مقاوم به تتراسايکلين 63 نمونه، شيوع ژن blaCTX-M در نمونه‌هاي مقاوم به ايمي پنم و پيپراسيلين و سفتازيديم 34 نمونه، شيوع ژن aadB در نمونه‌هاي مقاوم به استرپتومايسين و جنتامايسين 51 نمونه، از ميان 30 نمونه که به ايمي پنم و پيپراسيلين و سفتازيديم مقاوم بودند، 19 نمونه حاوي ژن blaIMP4 بودند. از ميان 63 نمونه که به تتراسايکلين مقاوم بودند، 48 نمونه حاوي ژن tetA بودند. از ميان 34 نمونه که به ايمي پنم و پيپراسيلين و سفتازيديم مقاوم بودند، 21 نمونه حاوي ژن blaCTX-M بودند. از ميان 51 نمونه که به استرپتومايسين و جنتامايسين مقاوم بودند، 36 نمونه حاوي ژن aadB بودند. در شکل 3 و جدول 6 درصد وجود ژنهاي مقاومت مشخص شده‌اند.نتایج الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز 1.5% در شکل 4 نشان داده شده است.
جدول 6: نتايج ميزان شيوع ژن مقاومت در نمونه‌هاي Acinetobacter baumannii
نام ژن | تعداد وجود ژن | تعداد نمونه‌هاي مقاوم | |
blaIMP4 | %63 | 19 | 30 |
tetA | %76 | 48 | 63 |
blaCTX-M | %62 | 21 | 34 |
aadB | %71 | 36 | 51 |
شکل 3- درصد شيوع ژنهاي مقاومت در نمونه‌هاي Acinetobacter baumannii
|
|
ژن blaIMP4 با طول باند bp741 | ژن tetA با طول باند bp1275 |
|
|
ژن blaCTX-M با طول باند bp912 | ژن aadB با طول باند bp516 |
شکل 4- الکترفورز محصول PCR ژنهاي مورد مطالعه روي ژل آگارز 5/1%
|
|
ژن blaIMP | ژن blaCTX |
|
|
ژن aadB | ژن tetA |
شکل 5- الکترفورز نتايج کنترل مثبت و منفي براي ژنهاي موردمطالعه
اسينتوباکتر بوماني به‌عنوان يک پاتوژن فرصت طلب بيمارستاني که در عفونت‌هاي بيمارستاني به‌ويژه در بخش مراقبت‌هاي بهداشتي (ICU) نقش بسيار مهمي دارد، شناخته‌شده است. مقاومت ضد ميکروبي در سويه‌هاي اسينتوباکتر بوماني به يک مشکل جهاني تبديل شده است (8). ظهور ايزوله‌هاي باليني اسينتوباکتر بوماني با فنوتيپ هاي مقاومت آنتي‌بيوتيکي مختلف، درمان عفونت‌هاي ناشي از اين پاتوژن را با مشکل مواجه کرده است. با توجه به منابع بررسي‌شده و همچنين با توجه به نتايج مطالعه حاضر بيشتر سويه‌هاي اسينتوباکتر بوماني از بخش (ICU) و از نمونه‌هاي دستگاه تنفسي بيماران به دست مي‌آيند؛ بنابراين اين بخش بيمارستاني و نمونه‌هاي ريه بايد به‌عنوان منبع اصلي اين باکتري‌ها همواره مدنظر قرار گيرد و در اين مورد بايد به مسائل مربوط به بخش و همچنين مسائل مربوط به کارکنان بخش مراقبت‌هاي ويژه نظير لوازم مورداستفاده جهت جابه‌جايي ترشحات دستگاه تنفسي و هم به ضدعفوني محيط داخلي بخش و هم به ضدعفوني صحيح وسايل و تجهيزات توجه گردد. Chang و همکاران (2015) و Liu و همکاران (2015) درکشورچين، Aksoy و همکاران (2013) در کشور ترکيه، بيشترين نمونه‌هاي جمع‌آوري‌شده را از بخش ICU اعلام کردند که تمام موارد فوق مشابه نتيجه مطالعه حاضر است(9-11). همچنين منابع و تعداد سويه‌هاي Acinetobacter baumannii در مطالعه حاضر نشان مي‌دهد که بيشترين سويه‌ها مربوط به نمونه‌هاي زخم درصورتي‌که کمترين نمونه‌ها مربوط به نمونه‌هاي کاتترو کشت مايع نخاعي CSF2)) ميباشد. در اين پژوهش آنتي‌بيوتيک پلي مکسين B فعاليت بهتري نسبت به ساير آنتي‌بيوتيک‌ها در برابر اسينتوباکتر بوماني داشته که البته خود نيز نسبت به مطالعات شجاع و همکاران که (2016) در اهواز و خسروشاهي و همکاران (2016) در تبريز انجام دادند با مقاومت پايين‌تري مواجه است، طوري که ميزان مقاومت در هر دو مطالعه نسبت به اين آنتي‌بيوتيک به ترتيب 0% و 16% بوده است(12, 13)، در مطالعه حاضر ميزان مقاومت در مطالعه حاضر 5% ميباشد؛ که اين امر نشان دهنده ثبات مقاومت سويه‌هاي باکتري اسينتوباکتر بوماني طي زمان ميباشد. کارباپنم ها در سال‌هاي گذشته به‌عنوان داروي انتخابي براي درمان عفونت‌هاي جدي بيمارستاني ناشي از اسينتوباکترها مورد توجه بوده‌اند. بااين‌حال سويه‌هاي اسينتوباکتربوماني مقاوم به کارباپنم در سراسر جهان گزارش شده‌اند و روند مقاومت به اين کلاس آنتي‌بيوتيکي باگذشت زمان در اين سويه‌ها رو به افزايش است. در اين مطالعه ميزان مقاومت نسبت به ايمي پنم 25% گزارش شد که اين ميزان تقريباً مشابه با مطالعات قبلي صورت پذيرفته بر روي اين باکتري در نقاط ديگر ايران است. در مطالعه صورت پذيرفته توسط خسروشاهي و شريفي (2017) روي ايزوله‌هاي باليني Acinetobacter baumannii در شهر تبريز ميزان مقاومت نسبت به ايمي پنم 7/26% گزارش شد (13). هاشمي زاده و همکاران (2010) در شيراز ميزان مقاومت به ايمي پنم را 13% گزارش دادند (14). در مطالعه پيماني و همکاران (2011) در تبريز ميزان مقاومت به ايمي پنم و مروپنم به ترتيب 54% و 56% بوده است (15). همچنين ميزان مقاومت در مطالعه انجام‌گرفته توسط شريف (2014) در شهر تهران به ايمي پنم 5/85% و مروپنم 28% بوده است(16). مطالعه حاضر که به هدف بررسي ارزيابي حضور ژنهاي بتالاکتامازي blaIMP4 و blaCTX-M، همچنين آنتي‌بيوتيک‌هاي آمينوگليکوزيدي و تتراسايکلين در سويه‌هاي باليني Acinetobacter baumannii جداسازي شده از بيماران بستري‌شده در بخش‌هاي مختلف بيمارستان‌هاي امامخميني، بهمن، بوعلي و اميرالمؤمنين در تهران صورت پذيرفته بود، نشان داد که اين سويه‌ها نسبت به سال‌هاي قبل به اغلب آنتي‌بيوتيک‌ها مقاومت بيشتري از خود نشان داده‌اند و اين احتمالاً به دليل افزايش توليد اين مقاومت‌ها توسط سويه‌هاي Acinetobacter baumannii باشد و اين نشان‌دهنده يک نگراني جدي است؛ بنابراين شناسايي سويه‌هاي مقاوم به کارباپنم و الگوي مقاومت ژني آن‌ها، به‌کارگيري راهکارهاي مناسب جهت کنترل عفونت‌هاي ناشي از سويه‌هاي Acinetobacter baumannii و تلاش براي کاهش ميزان انتقال آن‌ها در بخش‌هاي بيمارستاني، براي درمان مناسب عفونت‌هاي ايجادشده توسط اين سويه‌ها بسيار ضروري به نظر مي‌رسد. تکنيک PCR که در مطالعه حاضر به کار گرفته شد، يک روش بسيار سريع و قابل اطمينان براي شناسايي ژنهاي مقاوم به آنتي‌بيوتيک‌هاي فوق ذکر در سويه‌هاي باليني Acinetobacter baumannii ميباشد.
سپاسگزاری
اين مقاله برگرفته از رساله مقطع کارشناسي ارشد ميکروبيولوژِي مصوب در دانشگاه آزاد علوم پزشکي تهران، دانشکده علوم و فن آوي هاي نوين بود. در اين پژوهش از امکانات آزمايشگاه پژوهشی ميکروبيولوژي دانشکده علوم نوين، استفاده شد.
منابع
1. Nguyen M, Joshi S. Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii, and their importance in hospital‐acquired infections: a scientific review. Journal of applied microbiology. 2021;131(6):2715-38.
2. López M, Blasco L, Gato E, Perez A, Fernández-Garcia L, Martínez-Martinez L, et al. Response to bile salts in clinical strains of Acinetobacter baumannii lacking the AdeABC efflux pump: virulence associated with quorum sensing. Frontiers in cellular and infection microbiology. 2017;7:143.
3. Wong D, Nielsen TB, Bonomo RA, Pantapalangkoor P, Luna B, Spellberg B. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical microbiology reviews. 2017;30(1):409-47.
4. Viehman JA, Nguyen MH. Treatment options for carbapenem-resistant and extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii infections. Drugs. 2014;74(12):1315-33.
5. Poirel L, Bonnin RA, Nordmann P. Genetic basis of antibiotic resistance in pathogenic Acinetobacter species. IUBMB life. 2011;63(12):1061-7.
6. Li F-J, Starrs L, Burgio G. Tug of war between Acinetobacter baumannii and host immune responses. Pathogens and disease. 2018;76(9):ftz004.
7. Yusuf I, Skiebe E, Wilharm G. Evaluation of CHROMagar Acinetobacter and MacConkey media for the recovery of Acinetobacter baumannii from soil samples. Letters in Applied Microbiology. 2023;76(2):ovac051.
8. Medioli F, Bacca E, Faltoni M, Burastero GJ, Volpi S, Menozzi M, et al. Is it possible to eradicate carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii (CRAB) from endemic hospitals? Antibiotics. 2022;11(8):1015.
9. Chang Y, Luan G, Xu Y, Wang Y, Shen M, Zhang C, et al. Characterization of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolates in a Chinese teaching hospital. Frontiers in microbiology. 2015;6:910.
10. Liu Y, Liu X. Detection of AmpC β-lactamases in Acinetobacter baumannii in the Xuzhou region and analysis of drug resistance. Experimental and therapeutic medicine. 2015;10(3):933-6.
11. Aksoy MD, Çavuşlu Ş, Tuğrul HM. Investigation of metallo beta lactamases and oxacilinases in carbapenem resistant Acinetobacter baumannii strains isolated from inpatients. Balkan medical journal. 2015;32(1):79-83.
12. Shoja S, Moosavian M, Rostami S, Abbasi F, Tabatabaiefar MA, Peymani A. Characterization of oxacillinase and metallo-β-lactamas genes and molecular typing of clinical isolates of Acinetobacter baumannii in Ahvaz, South-West of Iran. Jundishapur journal of microbiology. 2016;9(5).
13. Khosroshahi SA, Farajnia S, Azhari F, Hosseini MK, Khanipour F, Farajnia H, et al. Antimicrobial Susceptibility Pattern and Prevalence of Extended-Spectrum β-Lactamase Genotypes among Clinical Isolates of Acinetobacter baumanii in Tabriz, North-West of Iran. Jundishapur Journal of Microbiology. 2017;10(6).
14. Hashemizadeh Z, Emami A, Rahimi M. Acinetobacter antibiotic resistance and frequency of ESBL-producing strains in ICU patients of Namazi Hospital (2008-2009). Journal of Inflammatory Diseases. 2010;14(2):47-53.
15. Peymani A, Nahaei M-R, Farajnia S, Hasani A, Mirsalehian A, Sohrabi N, et al. High prevalence of metallo-β-lactamase-producing Acinetobacter baumannii in a teaching hospital in Tabriz, Iran. Japanese journal of infectious diseases. 2011;64(1):69-71.
16. Sharif M. Molecular identification of TEM and SHV extended spectrum beta -lactamase in clinical isolates of Acinetobacter baumannii from Tehran hospitals. 2014.
