بررسی فرایند انعقاد خون بر روی زیستپلیمرها و مروری بر روشهای سنجش خونسازگاری آنها
الموضوعات :رحیم دهقان 1 , جلال برزین 2 , سید حسین ابطحیان 3 , بهنام دارابی 4 , حمیدرضا قادری 5
1 - پژوهشگاه پلیمر و پتروشیمی ایران
2 - گروه بایومتریال، پژوهشگاه پلیمر و پتروشیمی ایران
3 - کلینیک درمانی پاسارگاد، نورآباد ممسنی، ایران
4 - شیراز، دانشگاه علوم پزشکی شیراز، دانشکده پیراپزشکی، کد پستی: 14336- 71348
5 - فسا، دانشگاه علوم پزشکی فسا، دانشکده فناوری های نوین، گروه مهندسی بافت، کد پستی: 86688-74616
الکلمات المفتاحية:
ملخص المقالة :
در سال‌های اخیر استفاده از زیستپلیمرها در صنعت مهندسی پزشکی به‌شکل قابل توجهی گسترش پیدا کرده است، که از این دسته میتوان به دریچههای مصنوعی قلب، کاتتر، داربستهای قلبی و عروقی، رگ مصنوعی، پوشش دستگاه ضربانساز، غشای دستگاه همودیالیز و ... اشاره کرد. خونسازگاری از ضروریات زیستپلیمرها در کاربردهای پزشکی محسوب میشود. آگاهی از برهمکنشهای خون و پلیمر در توسعه و ساخت پلیمری خون‌سازگار اهمیت فراوانی دارد. موارد متعددی میتواند خونسازگاری زیست‌پلیمر را تحت تأثیر قرار دهد. خواص سطحی از قبیل آب‌دوستی، انرژی سطح و بار الکترواستاتیک از مهم‌ترین عوامل در کنترل خونسازگاری محسوب میشوند. در این تحقیق ضمن بررسی فرایند انعقاد خون بر روی زیستپلیمرها، به بررسی روشهای سنجش خونسازگاری بر روی آنها پرداخته شده است. این روشها عبارتند از: چسبندگی پروتئین که اولین مرحله در شروع فرایند انعقاد خون به حساب میآید، بررسی فعالیت پروتئین کالیکرئین که مسیر داخلی انعقاد خون را شامل میشود، زمانهای انعقادی شامل زمان ترومبین (TT)، زمان پروترومبین (PT)، زمان نسبی ترومبوپلاستین فعال شده (APTT) که مسیرهای خارجی، داخلی و مشترک انعقاد، میزان همولیز گلبولهای قرمز، چسبندگی سلولی و بررسی میکروسکوپی آنها و چسبندگی و فعالیت پلاکتها را مورد بررسی قرار میدهند. تغییر مورفولوژی پلاکتها از دیگر معیارهای شاخص سنجش خونسازگاری به‌شمار میآیند که در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفته است. در نهایت پلیمر خون‌سازگار بایستی از همه آزمونهای بیان‌شده با موفقیت عبور کند.
Investigation of Blood Coagulation Process on Biopolymers and Review on the Hemocompatibility Evaluation Methods
Rahim Dehghan1, Jalal Barzin11, Sayed Hossein Abtahian2, Behnam Darabi3, Hamidreza Ghaderi4
1. Biomaterials department, Iran polymer and petrochemical institute (IPPI), Tehran, Iran. P. O. Box:14975-112
2. Pasargad outpatient clinic, Shirza University of medical science, Nourabad Mamassani, Iran.
3. School of Paramedical Sciences, Shiraz University of medical science, Shiraz, Iran. Postal code: 71439-14693
4. School of Advanced Technologies in Medicine, Department of Tissue engineering, Fasa University of medical science, Fasa, Iran. Postal code: 74616-86688
Abstract
The use of biopolymers in the development of biomedical devices has extended in recent years. These devices are including prosthetic heart valves catheter, cardiovascular stents, artificial arteries, peacemakers, hemodialysis membranes, etc. Hemocompatibility is taken into account as one of the essential cases of biopolymers for biomedical applications. Knowing biopolymer-blood interaction is very considerable for the development of a hemocompatible biopolymer. Various factors can undergo the hemocompatibility of biopolymers. Surface properties such as hydrophilicity, surface energy, and electrostatic charge are the most important factor for the control of hemocompatibility. In this study, further blood coagulation mechanism on the biopolymers, evaluation methods of hemocompatibility is investigated. Methods include protein adsorption which is the first phenomenon of the blood coagulation process, investigation of kallikrein activity which evaluates intrinsic coagulation pathway, assessment of coagulation times such as thrombin time (TT), prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) which monitor extrinsic, intrinsic and common pathway of blood coagulation, hemolysis of erythrocytes, microscopy analysis of cell adhesion, platelet adhesion and activation. Change in platelet morphology is one of the main criteria for the investigation of blood compatibility. Finally, a hemocompatible polymer should pass all mentioned blood compatibility analyses. Herein, besides introducing hemocompatibility analyses, approaches for the improvement of this property is presented.
Keywords: Blood, Blood coagulation, Biopolymer, Hemocompatibility, surface modification.
بررسی فرایند انعقاد خون بر روی زیستپلیمرها و مروری بر روشهای سنجش خونسازگاری آنها
رحیم دهقان1، جلال برزین12، سید حسین ابطحیان2، بهنام دارابی3، حمیدرضا قادری4
1- تهران، پژوهشگاه پلیمر و پتروشیمی ایران، پژوهشکده علوم، گروه پلیمرهای زیست سازگار، صندوق پستی: 112-14975
2- کلینیک درمانی پاسارگاد، نورآباد ممسنی، ایران.
3- شیراز، دانشگاه علوم پزشکی شیراز، دانشکده پیراپزشکی، کد پستی: 14336- 71348
4- فسا، دانشگاه علوم پزشکی فسا، دانشکده فناوری های نوین، گروه مهندسی بافت، کد پستی: 86688-74616
چکیده
در سال‌های اخیر استفاده از زیستپلیمرها در صنعت مهندسی پزشکی به شکل قابل توجهی گسترش پیدا کرده است. که از این دسته میتوان به دریچههای مصنوعی قلب، کاتتر، داربستهای قلبی و عروقی، رگ مصنوعی، پوشش دستگاه ضربانساز، غشای دستگاه همودیالیز و ... اشاره کرد. خونسازگاری از ضروریات زیستپلیمرها در کاربردهای پزشکی محسوب میشود. آگاهی از برهمکنشهای خون و پلیمر در توسعه و ساخت پلیمری خون‌سازگار اهمیت فراوانی دارد. موارد متعددی میتواند خونسازگاری زیست‌پلیمر را تحت تأثیر قرار دهد. خواص سطحی از قبیل آب‌دوستی، انرژی سطح و بار الکترواستاتیک از مهم‌ترین عوامل در کنترل خونسازگاری محسوب میشوند. در این تحقیق ضمن بررسی فرایند انعقاد خون بر روی زیستپلیمرها، به بررسی روشهای سنجش خونسازگاری بر روی آنها پرداخته شده است. این روشها عبارتند از: چسبندگی پروتئین که اولین مرحله در شروع فرایند انعقاد خون به حساب میآید، بررسی فعالیت پروتئین کالیکرئین که مسیر داخلی انعقاد خون را شامل میشود، زمانهای انعقادی شامل زمان ترومبین (TT)، زمان پروترومبین (PT)، زمان نسبی ترومبوپلاستین فعال شده (APTT) که مسیرهای خارجی، داخلی و مشترک انعقاد را مورد بررسی قرار میدهند، میزان همولیز گلبولهای قرمز، چسبندگی سلولی و بررسی میکروسکوپی آنها و چسبندگی و فعالیت پلاکتها. تغییر مورفولوژی پلاکتها از دیگر معیارهای شاخص سنجش خونسازگاری به شمار میآیند که در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفته است. در نهایت پلیمر خون‌سازگار بایستی از همه آزمونهای بیان‌شده با موفقیت عبور کند.
واژه کلیدی: خون، انعقاد خون، پلیمر، خونسازگاری، سنجش خونسازگاری
مقدمه
مواد خون‌سازگار زیست‌موادی هستند که در کاربردهای در تماس با خون بدون هیچ‌گونه ایجاد خطری که منجر به فعال شدن سامانه انعقاد خون شود نقش‌آفرینی میکنند. خونسازگاری نیازی اساسی برای بسیاری از مواد مصنوعی مورد استفاده در کاربردهای پزشکی محسوب میشود. کاربردهای زیست‌مواد در تماس با خون بسیار زیاد است که از آنها میتوان به کاشتینهها و وسایل پزشکی قلبی و عروقی از جمله، کاتتر، داربستها، دریچههای مصنوعی قلب، پیوندهای رگ، دستگاه ضربانساز(پیس میکر)، ]1-3[ و حتی از دستگاههایی که در دسته مراقبتهای خارج از بدنی(extracorporeal) محسوب میشوند مانند صافی‌های جداساز سموم خون در فرایند همودیالیز ]5و4[، صافی‌های جداساز سلولهای سفید از خون ]7و6[ و دستگاه بای پس قلب-ریه نام برد]8[. فرایند تشکیل لخته بر روی مواد مصنوعی پیچیده است. زمانی که زیست‌پلیمری در تماس با خون قرار میگیرد، به‌سرعت سطح آن با لایه‌ای از پروتئین پوشیده میشود. پلاکتها بر روی پروتئینهای سطحی میچسبند و سپس فعال شده و بر روی سطح تجمع میکنند و از طرفی با تشکیل رشته فیبرین، لخته خون ایجاد میشود]9[. بنابراین برهم‌کنش پلیمر- خون به شکل قابل‌توجهی به خواص شیمیایی و فیزیکی سطح ماده بستگی دارد و به همین دلیل است که عموماً روش اصلاح سطح از محبوبترین روشها برای بهبود خونسازگاری محسوب میشود]10[. رویکردهایی که عموماً برای بهبود خونسازگاری استفاده میشود شامل 1- اصلاح سطح پلیمر با مواد سنتزی به‌منظور جلوگیری از برهم‌کنش خون و سطح پلیمر به‌خصوص جلوگیری از جذب پروتئینهای غیرخاص مانند اصلاح پلیمر با مواد آب‌دوست و موادی همچون زویتریونها که از مواد اثر بخش در جلوگیری از چسبندگی پروتئین هستند. 2- اصلاح پلیمر با مولکولهای زیست‌فعال مانند ضدلختهها، مهارکنندههای پلاکت و عوامل فیبرینولیتیک و تقلید از اندوتلیم عروق به عنوان ضدلخته‌ای ذاتی]11[.
در این مطالعه سعی بر آن بوده که پس از مطرح کردن مبحث انعقاد خون و آسیب‌شناسی انعقاد خون بر روی زیستپلیمرها، روشهای بررسی خونسازگاری که برای محقق از نظر ارزیابی خونسازگاری از اهمیت بالایی برخوردار است، مورد بررسی قرار گیرد.
خون
خون بافت زنده‌ای است که از دو بخش جامد و مایع تشکیل شده است، بخش جامد را سلولهای خون متشکل از سلولهای قرمز(erythrocyte)، سلولهای سفید(leucocyte) و پلاکتها(thrombocyte) تشکیل میدهند که 45 درصد حجمی خون را شامل میشوند. در بین سلولهای خونی، سلولهای قرمز بیش از 99 درصد از کل سلولها را تشکیل میدهند و نقش اصلی آنها رساندن اکسیژن از ریه به سمت بافتهای بدن و بازگرداندن دی‌اکسیدکربن از بافتها به سمت ریه است. در واقع این وظیفه توسط هموگلوبین موجود در سلول قرمز انجام میپذیرد. نقش سلولهای سفید خون دفاع از بدن در برابر پاتوژنهای حمله‌کننده به بدن است. تعداد سلولهای سفید بسیار کمتر از سلولهای قرمز است، اما تعداد آنها در مواجهه بدن با بیماریها و عفونتها در خون زیاد میشود. سلولهای سفید به دو دسته گرانولهها و غیرگرانولهها تقسیم‌بندی میشوند. گرانولهها شامل نوتروفیلها، زینوفیلها و بازوفیلها بوده و غیرگرانولهها مونوسیتها و لنفوسیتها را شامل میشود. نقش پلاکتها، انعقاد خون و جلوگیری از خون‌ریزی در بدن بوده که با فعال شدن و تجمع در کنار همدیگر نقش‌آفرینی میکنند. بخش مایع خون که پلاسما نام دارد شامل بیش از 92 درصد آب و مابقی آن انواع پروتئینها و املاح معدنی وجود دارند. از پروتئینهای مهم پلاسما میتوان به آلبومین، گلوبولینها، فاکتورهای انعقادی و فیبرینوژن اشاره کرد. از طرف دیگر پلاسما که حاوی بیش از 92 درصد آب است فشار خون مورد نیاز بدن را تأمین کرده و تنظیم‌کننده دمای بدن نیز است]12[.
انعقاد خون
خونسازگاری زیستپلیمرها از اهمیت بسزایی برخوردار است. عدم خونسازگاری پلیمر مشکلات جبران‌ناپذیری را برای بیمار ایجاد میکند. که در نهایت میتواند سبب امبولی و مرگ بیمار شود]13و12[. شکل 1 دو زیست‌پلیمر از جنس پلی‌اتیلن‌ترفتالات را نشان میدهد. همان‌گونه از تصویر مشخص است پلیمر پس از یک ماه کاشت در بدن بیمار دچار ترومبوز (لختگی) شدید شده که به وضوح نشانگر عدم خونسازگاری این پلیمر است]14[.
شکل 1 تشکیل لخته خون بر روی پلیمر از جنس پلی‌اتیلن‌ترفتالات(PET) ؛ (الف) قبل از کاشت، (ب) پس از کاشت یک‌ماهه و تشکیل لخته بر روی آن]14[.
فرایند انعقاد خون بر روی جراحت از طریق مجموعه‌ای از واکنشهای پیچیده انواعی از آنزیمها، پروتئینها و یونها انجام میشود. ابتدای این امر با حضور فاکتور بافتی که سبب فعال شدن مسیر خارجی انعقاد میشود آغاز میشود. مرحله دوم تماس با سطح غیراندوتلیالی مثل کلاژن و در ادامه فعال شدن مسیر داخلی انعقاد خون است. در هر دو مورد مسیرهای داخلی و خارجی تبدیل زیموژنهای(zymogen) غیرفعال به آنزیمهای پروتئولیتیک بر مبنای الگوی پشت سر هم که در نهایت منجر به فعال شدن پروترومبین(فاکتور دوم انعقاد) میشود، انجام میپذیرد. پروترومبین فعال شده سبب پلیمری‌شدن پروتئین فیبرینوژن و تبدیل آن به رشته نامحلول فیبرینی میشود. توالی فعال شدن فاکتورهای انعقادی در شکل 2 نشان داده شده است. همان‌گونه که در شکل 2 مشاهده میشود، هر دو مسیر داخلی و خارجی در نهایت سبب فعال شدن فاکتور X و تبدیل آن به Xa شده و از آن به بعد از طریق مسیر مشترک انعقاد سبب تشکیل فیبرین میشود]15و13[.
شکل 2 مسیرهای داخلی و خارجی و مشترک انعقاد خون (فرایند آبشاری انعقاد خون)]13[.
مسیر داخلی انعقاد خون
مسیر داخلی انعقاد مسیر پیچیدهای بوده و وابستگی بیشتری به زیست‌مواد و وسایل مصنوعی در مواجهه با خون دارد. آنزیم مرکزی این مسیر که سبب شروع مسیر داخلی انعقاد میشود فاکتور XII (فاکتور هاگمن) است. همان‌طور که در شکل 2 مشاهده میشود، فعال شدن این فاکتور سبب فعال شدن فاکتور XI(ترومبوپلاستین) میشود. فعال شدن اولیه فاکتور هاگمن به‌دلیل حضور یک یا چند کوفاکتور و نیز سطح غیراندوتلیالی شامل کلاژن و سطح زیست‌مواد است. کوفاکتورها درواقع پریکالیکرئین(PK) و کینینوژن با وزن مولکولی بالا(HMWK) هستند. ضمن اینکه خود فاکتور هاگمن فعال‌شده، سبب آب‌کافت پریکالیکرئینهای بیشتر و تولید کینینوژنهای بیشتر و خودکاتالیز شدن این فرایند میشود (شکل2). همچنین در این مرحله رهایش برادی کینین به‌عنوان عامل اتساع‌کننده عروق انجام میپذیرد ]13و12[.
مسیر خارجی انعقاد خون
شروع مسیر خارجی انعقاد، فعالیتی نسبتاً مستقیم است. فاکتور بافتی گلیکوپروتئین خنثایی از نظر آنزیمی است که بر روی سطح سلولهای زیادی موجود بوده اما در پروتئینهای پلاسما وجود ندارد. زمانی که بافتی آسیب میبیند، این فاکتور به داخل خون رهایش شده و با فاکتور VII (پروکانورتین) برهم‌کنش کرده و در مجموع سبب فعال شدن فاکتور X میشوند (شکل2)]13و12[.
مسیر مشترک انعقاد خون
مسیر مشترک هر دو مسیر داخلی و خارجی در نهایت سبب فعال شدن فاکتور X میشود که به آن Xa میگویند. در ادامه فاکتور Xa باعث فعال شدن پروترومبین(فاکتور2) و سپس تولید ترومبین میشود. ترومبین ایجاد شده در ادامه سبب تبدیل فیبرینوژن به فیبرین خواهد شد. همچنین ترومبین تولیدی در تماس با پلاکتها، سبب فعال شدن آنها از طریق تغییر در مورفولوژی، چسبیدن آنها به هم و رهایش ماده داخل آنها میشود و نیازمند تشکیل کمپلکس پروترومبیناز است]15[.
روشهای سنجش خونسازگاری پلیمرها
جذب سطحی پروتئین
با توجه به اینکه چسبندگی پروتئین بر روی سطح پلیمر اولین اتفاق پس از تماس پلیمر با خون است، لذا مقدار پروتئینهای چسبیده به سطح پلیمر موضوعی است که در سنجش خونسازگاری هر زیست‌پلیمری همواره مورد توجه است. چسبندگی پروتئین میتواند سبب فعال شدن آبشار انعقادی و فعال شدن پی در پی فاکتورهای انعقاد و در نهایت تشکیل لخته شود. پروتئین آلبومین که پرتعدادترین پروتئین خون بوده و فیبرینوژن که فاکتور اول انعقاد است، دو پروتئین رایج در ارزیابی خونسازگاری پلیمرها هستند]16[. اغلب برای بررسی میزان چسبندگی پروتئین آلبومین از طیف‌نگاری UV در طول موج 280 نانومتر یا از کیتهای تشخیص مخصوص استفاده میشود]17[. در مطالعه ای که توسط Tu و همکاران انجام گرفت به‌منظور بهبود خونسازگاری غشای پلیسولفون(PSf)، آن را با روش اصلاح سطح در ابتدا با آکریلیک‌اسید اصلاح شیمیایی کرده (PSf-AA) و سپس غشای حاصل با هیدروکسی پروپیل کیتوسان سولفونه شد(SHPCS-AA-PSf). در این مطالعه از چسبندگی با پروتئین آلبومین به‌عنوان اولین مرحله سنجش خونسازگاری استفاده شد. نتایجی که در شکل 3 آمده است گویای آن بود که غشاهای اصلاح‌شده دارای چسبندگی پروتئین کمتری بوده و در نتیجه خونسازگاری بهتری نسبت به غشای پلیسولفون اصلاح‌نشده دارد]18[.
شکل 3 میزان پروتئین جذب‌شده بر روی سطوح غشای پلیسولفون و پلیسولفون اصلاح‌شده]18[.
زمان پروترومبین(Prothrombin Time)
آزمون انعقادی پروترومبین (PT)، از طریق فعال شدن پروترومبین و فیبرینوژن، فرایند تولید ترومبین و تشکیل فیبرین را بر حسب زمان، از طریق مسیر خارجی و مسیر مشترک بررسی میکند. در این آزمون، با حضور یونهای کلسیم، ترومبوپلاستین بافتی کمپلکسهایی با فاکتور VII تشکیل داده و آن را فعال میکند ]20و19[. این شرایط سطح را برای اتصال و فعال شدن فاکتورهای X، V و II فراهم کرده و در انتها زمان مورد نیاز برای تشکیل لخته فیبرینی اندازهگیری میشود. محدوده نرمال نتیجه این آزمون بین 10 تا 13 ثانیه است. طولانی شدن این زمان نشان دهنده نقص در یک یا تعداد بیشتری از فاکتورها در مسیر خارجی انعقاد است]21و15[.
زمان نسبی ترومبوپلاستین و ترومبوپلاستین فعال‌شده(PTT/APTT)
زمان نسبی ترومبوپلاستین (PTT) و زمان نسبی ترومبوپلاستین فعال شده (APTT) برای یک منظور استفاده میشوند. با این تفاوت که در تعیین زمان APTT فعال‌کننده به‌منظور تسریع در زمان لختگی افزوده میشود. در واقع APTT نسخه حساس‌تری از PTT محسوب میشود. فرایند APTT زمان مورد نیاز برای فعال شدن پروترومبین و فیبرینوژن و در نتیجه تولید ترومبین و رشته پلیمری فیبرین را از طریق مسیر داخلی و مشترک انعقاد بررسی میکند. آزمایش APTT، روشی برای تعیین فعالیت پریکالیکرئین، کینینوژن با وزن مولکولی بالا و فاکتورهای XII، XI، IX، VIII، X، V، II و I است. APTT به‌دلیل کاهش فاکتور فیبرینوژن (فاکتورI) یا در حضور ضدلخته میتواند طولانی شود. محدوده نرمال APTT 25 تا 40 ثانیه است]21و15[.
زمان ترومبین(Thrombin Time)
همان‌طور که پیش‌تر اشاره شده تبدیل فیبرینوژن به رشته‌های نامحلول فیبرین در مرحله مسیر مشترک انعقاد صورت گرفته و به‌عنوان عامل اصلی انعقاد شناخته میشود. آزمون اندازهگیری زمان ترومبین به ارزیابی مسیر مشترک انعقاد می‌پردازد. بنابراین بررسی این مورد نیز به‌عنوان یکی از فاکتورهای خونسازگاری زیستپلیمرها مطرح میشود. زمان ترومبین تعیین‌کننده نرخ ترومبینی است که سبب تبدیل فیبرینوژن به فیبرین و تشکیل لخته خون میشود. در این آزمون با اضافه کردن ترومبین به نمونه پلاسمای خون، فیبرینوژن به فیبرین میشود. مقدار نرمال این آزمون در حدود 15 تا 20 ثانیه است. طولانی‌شدن نتیجه آزمون زمان ترومبین مبین غلظت کم فیبرینوژن یعنی کمتر از 100 میلیگرم در هر دسی‌لیتر است]21و15[. در شکل 4 فرایند انعقاد خون و تفاوت ارزیابی زمان های انعقادی نشان داده شده است.
شکل 4 فرایند انعقاد خون و تفاوت ارزیابی زمانهای انعقادی PTT (APTT)، PT و TT ]22[.
در مطالعهای که توسط Zhu و همکاران انجام گرفت به‌منظور ارتقای خواص ضدگرفتگی (antifouling) و بهبود خونسازگاری غشای پلیسولفون برای استفاده در فرایند همودیافیلتراسیون، مونومر وینیل پیرولیدون با روش پلیمری‌شدن درجا بر روی غشای پلیسولفون پلیمریزه شد. آنها برای ارزیابی خونسازگاری غشا از آزمون PT به‌منظور بررسی مسیر خارجی و مشترک انعقاد و از آزمون APTT برای بررسی مسیر داخلی و مشترک انعقاد استفاده کردند (شکل5). طولانی شدن زمان انعقاد نسبت به پلاسمای خون و همین‌طور غشای پلیسولفون اصلاح‌نشده، گویای بهبود خونسازگاری غشای اصلاح‌شده با پلی‌وینیل‌پیرولیدون بوده است]23[.
شکل 5 نتایج آزمون زمانهای انعقاد (الف) PT و (ب) APTT پلاسمای خالی از پلاکت (PPP)، غشای پلیسولفون (M0) و پلیسولفون اصلاح‌شده با پلی‌وینیل‌پیرولیدون (M6) ]23[.
ارزیابی تبدیل پریکالیکرئین به کالیکرئین (Pre-Kallikerin to Kallikerin)
پریکالیکرئین یکی از پروآنزیم‌های پلاسمای خون است که هنگام تماس با سطح فاقد خونسازگاری مطلوب، از طریق فعال شدن فاکتور XII انعقاد موسوم به فاکتور هاگمن، فعال شده و به کالیکرئین تبدیل میشود. بنابراین تبدیل پریکالیکرئین به کالیکرئین را میتوان به‌عنوان معیاری برای ارزیابی فعال شدن مسیر داخلی انعقاد ارزیابی کرد. در مطالعهای که توسط Huang و همکاران انجام گرفت، به منظور بهبود خونسازگاری غشای پلیسولفون، هپارین را از طریق روش کلرومتیل‌دار کردن و سپس آمین‌دار کردن به سطح غشای پلیسولفون متصل شد. در این مطالعه یکی از روشهایی که برای ارزیابی خونسازگاری غشا استفاده شد، بررسی فعالیت کالیکرئین بوده است. نحوه انجام این آزمون از طریق تماس پلاسمای خون با سطح پلیمر و سپس جمع‌آوری پلاسمای در تماس با پلیمر و اضافه کردن ماده رنگزا به آن بوده که در نهایت غلظت کالیکرئین از طریق تغییر در چگالی نوری ماده ارزیابی شد. آنها فعال شدن کالیکرئین را بر روی پلیسولفون (PSf)، پلیسولفون کلرومتیل دار شده (PSf-CH2Cl)، پلیسولفون آمین‌دار شده (PSf-NH2) و پلیسولفون هپارینه‌شده (PSf-Hep) مورد بررسی قرار دادند. همچنین به‌منظور مقایسه، نتایج را با سطح شیشه که یکی از شاخص‌ترین موارد در فعال کردن کالیکرئین است، مورد بررسی قرار دادند. مطالعه آنها نشان داد که شیشه بیشترین میزان فعالیت کالیکرئین را در مدت زمان 5/0 و 1 ساعت دارا بوده است. همچنین پلیسولفون اصلاح شده با هپارین کمترین میزان فعال شدن کالیکرئین را داشته است که از این بررسی نیز میتوان نتیجه گرفت که پلیسولفون اصلاح‌شده با هپارین سبب فعال شدن کالیکرئین نخواهد شد و در نتیجه مسیر داخلی انعقاد فعال نمیشود که از این رو میتوان پلیسولفون هپارینه‌شده را ماده‌ای خون سازگار قلمداد کرد. همان‌گونه که در شکل 6 مشاهده میشود تغییر شیب خطوط رسم شده به میزان فعالیت کالیکرئین ارتباط داده میشود]24[.
شکل 6 سینیتیک فعالیت کالیکرئین. اندازهگیری پس از الف) 30 و ب) 60 دقیقه برای پلیسولفون و پلیسولفون اصلاح‌شده]24[.
بررسی میزان همولیز خون
نرخ همولیز یکی دیگر از پارامترهایی است که به کمک آن خونسازگاری سطح مواد مورد ارزیابی قرار میگیرد. همولیز با میزان آسیبدیدگی گلبولهای قرمز ارتباط داشته که در اثر آن سیتوپلاسم درون آن که هموگلوبین است آزاد میشود. برای اینکه پلیمر دارای خاصیت خونسازگاری مطلوب باشد بایستی میزان همولیز آن کمتر از 5 درصد باشد]25[. در مطالعهای که توسط Venault و همکاران انجام گرفت، برای بررسی خونسازگاری غشای پلی‌وینیلیدن فلوراید اصلاح‌شده با کوپلیمر پلی‌استایرن-بلاک- پلیاتیلنگلیکول متاکریلات( PS-B-PEGMA) ، از آزمون بررسی میزان همولیز استفاده شد و نتیجه این آزمایش مشخص کرد که غشای اصلاح‌شده سازگاری خوبی با سلولهای خونی داشته و باعث لیز شدن گلبول های قرمز نمیشود(شکل7) ]26[.
شکل 7 میزان همولیز گلبولهای قرمز بر روی کوپلیمر]26[.
بررسی میکروسکوپی مورفولوژی سلولی
یکی دیگر از خصوصیات پلیمر خون‌سازگار، داشتن تمایل(Affinity) به سلولهای بدن است. سطح خون‌سازگار بایستی سازگاری خوبی با سلولهای بدن داشته باشد تا منجر به فعال شدن سیستم ایمنی بدن نشود. زمانی که که زیست‌پلیمر در معرض سلولها قرار داده میشود، در صورتی که سطح، محل امنی برای تماس با سلول و رشد آن باشد، شاهد چسبندگی سلولی بر روی سطح و همین‌طور تغییر مورفولوژی سلولها خواهیم بود که با میکروسکوپهای نوری و الکترونی قابل رصد کردن است. یک سطح مناسب پس از چسبیدن سلول بایستی منجر به تغییر مورفولوژی سلولی از حالت گرد به رشد فیلوپدیال (Filopodial)، سیتوپلاسمیک وبینگ (Cytoplasmic webbing) و پهن شدن مرکز سلولی (Flattening of central mass) شود که نشانگر زیست‌سازگاری سطح مورد نظر برای سلول است. در شکل 8 مراحل چسبیدن سلول به سطح و رشد آن نشان داده شده است]27[.
شکل 8 تصویر میکروسکوپ نوری از تغییر مورفولوژی سلولها بر روی غشای پلیاترسولفون؛ الف) چسبیدن سلول، ب) رشد فیلوپودیال، ج) پهن شدن مرکز سلولی و د) پهن شدن کامل سلول را نشان میدهد]27[.
در مطالعهای که توسط دهقان و برزین انجام شد، از غشای پلیسولفون اصلاح‌شده با اکسیدگرافن عامل‌دارشده با پلی‌ساکارید سولفاته به نام کاراگینان به‌منظور جداسازی کلسترول بد(LDL) از پلاسمای خون استفاده شد. نتایج نشان داد که حضور کاراگینان بر روی صفحات اکسیدگرافن، با طولانی شدن زمانهای انعقادی PT و APTT و همچنین بهبود خاصیت چسبندگی و رشد سلولی، خونسازگاری غشای اصلاح‌شده بهبود یافته است. شکل 9 چسبندگی و رشد کامل سلولها در مجاورت غشای پلیسولفون اصلاح‌شده را توسط تصویربرداری با میکروسکوپهای نوری و الکترونی نشان میدهد]28[.