مروری بر غشاهای بر پایه پلی سولفون در جداسازی لیپوپروتئین با چگالی کم از خون
الموضوعات :رحیم دهقان 1 , جلال برزین 2 , بهنام دارابی 3 , حمیدرضا قادری 4
1 - گروه بایومتریال، پژوهشگاه پلیمر و پتروشیمی ایران
2 - گروه بایومتریال، پژوهشگاه پلیمر و پتروشیمی ایران
3 - شیراز، دانشگاه علوم پزشکی شیراز، دانشکده پیراپژشکی
4 - فسا، دانشگاه علوم پزشکی فسا، دانشکده فناوری های نوین، گروه مهندسی بافت
الکلمات المفتاحية:
ملخص المقالة :
بیماری های قلبی و عروقی شایع ترین دلیل مرگ و میر در سرار جهان به شمار می آید. افزایش بیش از حد سطح لیپوپروتئین با چگالی کم (low density lipoprotein) در خون به عنوان اصلی ترین دلیل بیماری های عروق کرونری و تصلب شرایین محسوب می شود. جداسازی LDL از خون یکی از انتخاب های سخت افزاری برای این منظور و بخصوص بیمارانی که با دارودرمانی بهبود نمی یابند می باشد. روش های جداسازی LDL بطور کلی به دو دسته روش های مبتنی بر جذب و فیلتراسیون آبشاری تقسیم بندی می شوند. در این مطالعه علاوه بر اینکه به بررسی مروری این روش ها پرداخته شده، استفاده از غشاهای برپایه پلی سولفون در جداسازی LDL مورد بررسی قرار داده شده است. سپس با الهام از ساختار گیرنده ذاتی LDL در بدن (LDLR)، روش های اصلاح متفاوتی همچون هپارینه کردن با روش های مختلف از قبیل کلرومتیل دار کردن غشا، اصلاح با پلاسمای آمونیاک، اصلاح از طریق پلی دپامین و پلی اتیلن ایمین، گلیکوزیله کردن غشا با روش شیمی کلیک و اتصال آلژینات سولفات به سطح غشای پلی-سولفون از روش های اصلاحی بوده که به منظور جذب LDL از آن استفاده شده است. به منظور بررسی صحت فرآیند اصلاح از آزمون های مختلفی همچون طیف سنجی تبدیل فوریه (ATR-FTIR) ، اسپکتروسکوپی با اشعه ایکس( XPS) ، اندازه گیری زاویه تماس آب و پتانسیل زتا استفاده می شود. همچنین خون سازگاری این دسته از غشاها از موارد اساسی در توسعه آنها برای کاربرد ذکر شده میباشد.
1. Cai A., Li L., Zhang Y., Mo Y., Mai W., and Zhou Y., Lipoprotein (a): A Promising Marker for Residual Cardiovascular Risk Assessment, Diseases Markers, 35, 551-559, 2013.
2. National Institute of Health, http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/blood.html, Available in September 2021.
3. Dehghan R. and Koosha M., Specification of Polyurethane as Prosthetic Heart Valve, Polymerization, 5, 48-60, 2015.
4. Marinetti G.V., Disorders of Lipid Metabolism, New York, Springer Science & Business Media, 89-95, 2012.
5. De Castro-Orós I., Pocoví M., and Civeira F., The Genetic Basis of Familial Hypercholesterolemia: Inheritance, Linkage, and Mutations, The Application of Clinical Genetics, 3, 53-54, 2010.
6. Yang C. Y., Chen S. H., Gianturco S. H., Bradley W. A., Sparrow J. T., Tanimura M., Li W. H., Sparrow D. A., Deloof H., Rosseneu M., and Lee F.S., Sequence, Structure, Receptor-Binding Domains and Internal Repeats of Human Apolipoprotein B-100, Nature, 323, 738-742, 1986.
7. Fox K.M., Gandhi S.K., Bullano M.F., Ohsfeldt R.L., and Davidson M.H., Low-Density Lipoprotein Levels and Dyslipidemia Treatment in Patients Diagnosed with Atherosclerosis, In Circulation, 117, E425-E426, 2008.
8. Huang X.J., Guduru D., Xu Z.K., Vienken J., and Groth T., Immobilization of Heparin on Polysulfone Surface for Selective Adsorption of Low-Density Lipoprotein (LDL), Acta Biomaterialia, 6, 1099-1106, 2010.
9. Duell P.B., Low-Density Lipoprotein (LDL) Apheresis, Dyslipidemias, NewYork, Humana Press, 2015.
10. Hudgins L.C., Gordon B.R., Parker T.S., Saal S.D., Levine D.M., and Rubin A.L., LDL Apheresis: An effective and Safe Treatment for Refractory hypercholesterolemia, Cardiovascular Drug Reviews, 20, 271-280, 2002.
11. Encyclopedia Britannica, Low density lipoprotein physiology, https://www.britannica.com/science/low-density-lipoprotein, available in June 2021.
12. Orlova E.V., Sherman M.B., Chiu W., Mowri H., Smith L.C., and Gotto A.M., Three-Dimensional Structure of Low Density Lipoproteins by Electron Cryomicroscopy, Proceedings of the National Academy of Sciences, 96, 8420-8425, 1999.
13. Moffatt R.J. and Stamford B., Lipid Metabolism and Health. CRC Press, 2005.
14. Camacho P., Clinical Endocrinology and Metabolism, Manson publishing, Maywood illions, USA , 171-173, 2011.
15. Harisa G.I., and Alanazi F.K., Low Density Lipoprotein Bionanoparticles: From Cholesterol Transport to Delivery of Anti-Cancer Drugs, Saudi Pharmaceutical Journal, 22, 504-515, 2014.
16. Bambauer R., Bambauer C., Lehmann B., Latza R., and Schiel R., LDL-Apheresis: Technical and Clinical Aspects, The Scientifc World Journal, 2012.
17. Selecti cure H19 cascade filter, www.membrana.com, available in may 2020.
18. Borberg H., Results of An Open, Longitudinal Multicenter LDL-Apheresis Trial, Transfusion Science, 20, 83–94, 1999.
19. Bambauer R., Schiel R., Latza R., Current Topics on Low-Density Lipoprotein Apheresis Methods. Therapeutic Apheresis, 5, 293–300, 2001.
20. Seidel D., Wieland H., Ein Neues Verfahren zur Selektiven Messung und Extrakorporalen Elimination von Low-Density Lipoproteinen, Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, 20, 684. 1982.
21. Bambauer R., Olbricht C.J., and Schoeppe E., Low-Density Lipoprotein Apheresis for Prevention and Regression of Atherosclerosis: Clinical Results, Therapeutic Apheresis, 1, 242–248, 1997.
22. Bosch T., Lennertz A., Schmidt B., Fink E., Keller C., DALI Apheresis in Hyperlipidemic Patients: Biocompatibility, Efcacy, and Selectivity of Direct Adsorption of Lipoprotein from Whole Blood, Artificial Organs, 24, 81–90, 2000.
23. Barzin J., Feng C., Khulbe K.C., Matsuura T., Madaeni S.S., and Mirzadeh H., Characterization of Polyethersulfone Hemodialysis Membrane by Ultrafiltration and Atomic Force Microscopy, Journal of Membrane Science, 237, 77-85. 2004.
24. Fang F., Zhu X.Y., Chen C., Li.J., Chen D.J., and Huang X.J., Anionic Glycosylated Polysulfone Membranes for the Affinity Adsorption of Low-Density Lipoprotein via Click Reactions, Acta biomaterialia, 49, 379-387, 2017.
25. Wang L., Fang F., Liu Y., Li J., and Huang X., Facile Preparation of Heparinized Polysulfone Membrane Assisted by Polydopamine/Polyethyleneimine Co-deposition for Simultaneous LDL Selectivity and Biocompatibility, Applied Surface Science, 385, 308-317, 2016.
26. Huang X.J., Guduru D., Xu Z.K., Vienken J., and Groth T., Blood Compatibility and Permeability of Heparin‐Modified Polysulfone as Potential Membrane for Simultaneous Hemodialysis and LDL Removal. Macromolecular Bioscience, 11, 131-140, 2011.
27. Li J., Huang X.J., Ji J., Lan P., Vienken J., Groth T., and Xu Z.K., Covalent Heparin Modification of a Polysulfone Flat Sheet Membrane for Selective Removal of Low‐Density Lipoproteins: A simple and versatile method. Macromolecular Bioscience, 11, 1218-1226, 2011.
28. Wang W., Huang X.J., Cao J.D., Lan P., and Wu W., Immobilization of Sodium Alginate Sulfates on Polysulfone Ultrafiltration Membranes for Selective Adsorption of Low-Density Lipoprotein, Acta Biomaterialia, 10, 234-243, 2014.
29. Aksoy E.A., Synthesis and Surface Modification Studies of Biomedical Polyurethanes to Improve Long-term Biocompatibility, Ph.D Thesis, Middle East Technical University, July 2008.
Review on the Polysulfone Based Membranes for Separation of Low-Density Lipoprotein from Blood
Rahim Dehghan1, Jalal Barzin11, Sayed Hossein Abtahian2, Behnam Darabi3, Hamidreza Ghaderi4
1. Biomaterials Department, Iran Polymer and Petrochemical Institute (IPPI), Tehran, Iran. P. O. Box:14975-112
2. Pasargad outpatient clinic, Shiraz University of Medical Science, Nourabad Mamassani, Iran.
3. School of Paramedical Sciences, Shiraz University of Medical Science, Shiraz, Iran. Postal code: 71439-14693
4. School of Advanced Technologies in Medicine, Departement of Tissue engineering, Fasa University of medical science, Fasa, Iran. Postal code: 74616-86688
Abstract
Cardiovascular diseases are the most common cause of fatality all over the world. A severe increase of low-density lipoprotein (LDL) concentration in blood is recognized as the main cause of coronary artery disease (CAD) and atherosclerosis. LDL apheresis from blood is one of the extracorporeal options for patients suffering from this disorder which drug therapy is not effective for them. LDL apheresis is classified in cascade filtration and adsorption-based methods. In this study further reviewing all LDL apheresis techniques, polysulfone (PSU) membranes for selective adsorption of LDL were investigated. By inspiring from inherent LDL receptor (LDLR) of body, different methods including heparinization of PSU membrane by various methods such as chloromethylation, treatment with ammonia plasma and co-deposition of polydopamine and polyethyleneimine can be used for adsorption of LDL from the blood. Also, membrane ionic glycosylation by click chemistry and grafting of alginate sulfate on the surface of PSU membrane to adsorption of LDL were reviewed. To investigate surface modification accuracy, different analyses such as X-ray photo spectroscopy (XPS), Attenuated total reflectance Fourier transform infrared (ATR-FTIR), 
-Potential and water contact angle are used. Blood compatibility is another factor for the development of these membranes for defined application.
Keywords: membrane, blood, low-density lipoprotein, filtration, adsorption.
مروری بر غشاهای بر پایه پلی سولفون در جداسازی لیپوپروتئین با چگالی کم از خون
رحیم دهقان1، جلال برزین12، سید حسین ابطحیان2، بهنام دارابی3، حمیدرضا قادری4
1- تهران، پژوهشگاه پلیمر و پتروشیمی ایران، پژوهشکده علوم، گروه پلیمرهای زیست سازگار، صندوق پستی: 112-14975
2- کلینیک درمانی پاسارگاد، نورآباد ممسنی، ایران.
3- شیراز، دانشگاه علوم پزشکی شیراز، دانشکده پیراپژشکی، کد پستی: 14336- 71348
4- فسا، دانشگاه علوم پزشکی فسا، دانشکده فناوری های نوین، گروه مهندسی بافت، کد پستی: 86688-74616
چکیده
بیماری های قلبی و عروقی شایع ترین دلیل مرگ و میر در سرار جهان به شمار میآید. افزایش بیش از حد سطح لیپوپروتئین با چگالی کم(low density lipoprotein) در خون به عنوان اصلی ترین دلیل بیماریهای عروق کرونری و تصلب شرایین محسوب میشود. جداسازی LDL از خون یکی از انتخابهای سخت افزاری برای این منظور و بخصوص بیمارانی که با دارودرمانی بهبود نمییابند میباشد. روشهای جداسازی LDL بطور کلی به دو دسته روشهای مبتنی بر جذب و فیلتراسیون آبشاری تقسیمبندی میشوند. در این مطالعه علاوه بر اینکه به بررسی مروری این روشها پرداخته شده، استفاده از غشاهای برپایه پلی سولفون در جداسازی LDL مورد بررسی قرار داده شده است. سپس با الهام از ساختار گیرنده ذاتی LDL در بدن (LDLR)، روش های اصلاح متفاوتی همچون هپارینه کردن با روشهای مختلف از قبیل کلرومتیل دار کردن غشا، اصلاح با پلاسمای آمونیاک، اصلاح از طریق پلی دپامین و پلیاتیلن ایمین، گلیکوزیله کردن غشا با روش شیمی کلیک و اتصال آلژینات سولفات به سطح غشای پلیسولفون از روش های اصلاحی بوده که به منظور جذب LDL از آن استفاده شده است. به منظور بررسی صحت فرآیند اصلاح از آزمونهای مختلفی همچون طیف سنجی تبدیل فوریه (ATR-FTIR) ، اسپکتروسکوپی با اشعه ایکس( XPS) ، اندازهگیری زاویه تماس آب و پتانسیل زتا استفاده میشود. همچنین خون سازگاری این دسته از غشاها از موارد اساسی در توسعه آنها برای کاربرد ذکر شده میباشد.
واژگان کلیدی: غشا، خون، لیپوپروتئین با چگالی کم، فیلتراسیون، جذب
مقدمه
بیماریهای قلبی و عروقی شایع ترین دلیل مرگ و میر در سراسر جهان است. افزایش مبتلایان به بیماریهای گرفتگی عروق کرونری قلب(CAD) و تصلب شرایین(Atherosclerosis) و ترومبوز مغزی، محققان را به تلاش هرچه بیشتر به سمت کاهش میزان این بیماریها سوق داده است. کلسترول موجود در خون نقش موثری در پیشرفت بیماریهای قلبی و عروقی دارد]1[. خون بافت زندهای است که از دو بخش جامد و مایع تشکیل شده است. بخش جامد را سلولهای خونی شامل سلولهای قرمز خون(اریتروسیتها)، سلولهای سفید خون(لوکوسیتها) و پلاکتها(ترومبوسیتها) تشکیل میدهند که 45 درصد از خون کامل را شامل میشوند و بخش مایع که پلاسما نام دارد شامل آب که بیش از 90 درصد پلاسما را تشکیل میدهد، و پروتئینها و املاح معدنی میباشد]3و2[. کلسترول در خون توسط یک سری از لیپوپروتئینها از جمله لیپوپروتئین با چگالی خیلی کم(VLDL)، لیپوپروتئین با چگالی کم (LDL)، لیپوپروتئین با چگالی متوسط(IDL) و لیپوپروتئین با چگالی بالا(HDL) حمل میشود و اعتقاد بر این است که LDL که حاوی میزان زیادی کلسترول بوده، یکی از اصلیترین عوامل در توسعه بیماری تصلب شرایین است]5و4[. زمانیکه سطح بالای LDL در خون با غلظت پایین HDL همراه شود، روند تجمع کلسترول در نواحی درون سلولی و بیرون سلولی دیواره سرخرگی افزایش یافته که منجر به تشکیل پلاک و انسداد در شریان شده و میتواند سبب بیماریهای قلبی و عروقی شود. بنابراین کاهش سطح LDL در خون یک راهکار درمانی برای کاهش خطر بیماریهای قلبی و عروقی و عروق مغزی به شمار میآید]6-8[. درمان بیمارییهایی همچون هایپرکلسترولمی فامیلی(Familial Hypercholesterolemia) که به دلیل نقص ژنتیکی عدم وجودگیرندههای LDL در بدن بیمار است، با دارودرمانی موثر نبوده و نیازمند بهرهمندی از دیگر روشها است]9[. بنابراین جداسازی LDL از خون بصورت خارج بدنی(Extracorporeal) به عنوان یک روش اثربخش برای افزایش طول عمر این نوع بیماران محسوب میشود. از سال 1996میلادی سازمان غذا و داروی آمریکا استفاده از روش جداسازی LDL را برای بیمارانی که از میزان LDL بالای 300میلیگرم بر دسی لیتر و بیمارانی که به بیماری عروق کرونری مبتلا هستند و سطح LDL خون آنها بالاتر از 200 میلیگرم بر دسی لیتر است تایید کرد]10[. با توجه به آمار بالای بیماریهای قلبی و عروقی در ارتباط با افزایش سطح LDL در خون و ضرورت هر چه بیشتر جهت کاهش میزان آن در خون، به منظور آشنایی متخصصان حوزه پلیمر، در این مطالعه مروری سعی شده است تا ضمن معرفی روشهای جداسازی کلسترول LDL به صورت خارج بدنی، آخرین مطالعات در زمینه غشاهای پلیمری در راستای هدف ذکر شده مورد بررسی قرار گیرد.
انواع لیپوپروتئینها و عملکرد آنها
هر ذره لیپوپروتئینی دارای دو بخش مجزا است: 1- بخش مرکزی که شامل لیپیدهای آب گریز تری آسیل گلیسرول و استرکلسترول بوده و 2- بخش قشری شامل یک لایه لیپیدهای آمفی پاتیک فسفولیپید، گلیکولیپید و کلسترول آزاد به همراه آپولیپوپروتئینها است.
اساس تقسیم بندی لیپوپروتئینها چگالی آنها است که عبارتند از: 1- شیلومیکرونها(CM) که در بین لیپوپروتئینها دارای بزرگترین اندازه، بیشترین درصد تریگلیسرید و کمترین وزن مخصوص است و آپولیپروتئین اصلی شیلومیکرون Apo-B48 است.2- لیپوپروتئین با وزن مخصوص بسیار پایین(VLDL) که حاوی 90 درصد چربی است(60درصد تری گلیسرید و مابقی چربیهایی نظیر فسفولیپید و استرکلسترول). آپولیپروتئینهای VLDL شامل Apo B100 و Apo C-𝔩𝔩 است.3- لیپوپروتئین با وزن مخصوص پایین(LDL) با بیشترین میزان کلسترول که در بخش بعدی به تفسیر در مورد آن پرداخته خواهد شد. 4- لیپوپروتئین با وزن مخصوص بالا(HDL) که حاوی حدود 50 درصد لیپید(2 درصد تریگلیسرید،30 درصد فسفولیپید و 18 درصد کلسترول آزاد) و دارای آپولیپروتئینهایی مانند Apo E و Apo C-𝔩𝔩 است. در جدول 1 مشخصات لیپوپروتئینهای خون آورده شده است]11[.
جدول1- مشخصات لیپوپروتئینهای خون
ردیف | لیپوپروتئین | چگالی(g/dl) | قطر(nm) |
1 | CM | 95/0> | 75-1200 |
2 | VLDL | 006/1 – 95/0 | 30-80 |
3 | IDL | 019/1 – 006/1 | 25-35 |
4 | LDL | 063/1 – 006/1 | 18-25 |
5 | HDL | 210/1 – 006/1 | 5-12 |
لیپوپروتئین با دانسیته کم(LDL)
VLDL در پلاسما تحت تاثیر آنزیم لیپوپروتئین لیپاز (LPL) از بار تریگلیسریدی خود تا حدودی تهی شده و به IDL تبدیل میشود. در حین این فرآیند، مقداری استرکلسترول نیز از HDL به VLDL اضافه میشود. IDL نیز تحت تاثیر لیپوپروتئین لیپاز مقداری از بار تریگلیسریدی خود را از دست داده و به LDL تبدیل میگردد. LDL حاوی 22 درصد ApoB100، 6 درصد تریگلیسرید، 22 درصد فسفولیپید، 8 درصد کلسترول آزاد و 42درصد استرکلسترول است ]12[. حدود نصف LDL پلاسمای خون از طریق گیرندههای Apo B100 جذب سلولهای کبد و نیمه دیگر به واسطه همین گیرنده جذب سایر سلولهای بدن میشود. در مقایسه با سایر لیپوپروتئینها، LDL دارای بیشترین میزان کلسترول است. بنابراین با افزایش میزان ذرات LDL در پلاسما، میزان کلسترول و درنتیجه خطر ابتلا به تصلب شرایین افزایش مییابد]14و13و5[.شکل1 بصورت شماتیک ساختار LDL را نشان میدهد.
شکل1- ساختار کلسترول LDL ]15[.
انواع روشهای جداسازی LDL
تا به امروز 6 روش جداسازی LDL مختلف توسعه پیدا کرده است که شامل:1- فیلتراسیون آبشاری(cascade filtration)، 2- جذب ایمنی(immunoadsorption)، 3- رسوب LDL با استفاده از تزریق هپارین(HELP)، 4- جذب LDL بر پایه سلولز دکستران سولفات، 5-جذب مستقیم لیپوپروتئین از خون(Liposorber) و6- Liposorber D میباشد.
فیلتراسیون آبشاری
فیلتراسیون آبشاری یا فیلتراسیون دوتایی جداساز پلاسما(Double filtration plasmapheresis) توسط Agishi و همکاران در ژاپن توسعه پیدا کرده و اولین روش نیمهگزینش پذیر(Semi-selective) بوده که برای بیماران هایپرکلسترولمی فامیلی بکار برده شده است. در این سامانه، ابتدا خون سیاهرگی خروجی از بدن بیمار به سمت فلیتری هدایت میشود که در آنجا سلولهای خونی از پلاسمای خون جدا میشود. پلاسمای جدا شده به منظور حذف LDL از آن به سمت فیلتر دوم هدایت میشود. این فیلتر از غشایی تشکیل شده که دارای آستانه شکست جرم مولکولی (MWCO) تقریبا یک میلیون دالتون است. کلسترول LDL دارای وزن مولکولی تقریبا 2300000 دالتون بوده و بنابراین توسط غشا نگه داشته میشود. همچنین دیگر مولکولها که بزرگتر از یک میلیون دالتون هستند توسط غشا نگه داشته میشوند در حالیکه اجزای دیگر پلاسما که کمتر از یک میلیون دالتون هستند از غشا عبور میکنند و به بدن بیمار برگشت داده میشود. بنابراین با جداسازی پلاسمایی معادل 2500 تا 3000 میلیلیتر، کل کلسترولی که میتواند کاهش یابد حدود 30 تا 50 درصد از مقدار اولیه بوده و مقدار کلسترول LDL معادل 30 تا 45 درصد نسبت به مقدار اولیه کاهش مییابد. در انتها پس از تصفیه پلاسمای خون از عامل بیماری زا، پلاسمای تصفیه شده به سلول های جدا شده در مرحله اول اضافه شده و به بدن بیمار برگردانده میشود]16[.
به دلیل توزیع منافذ نامنظم با قطرهای مختلف در فیلتراسیون آبشاری، اجزای پلاسما با وزن مولکولی کمتر نیز میتواند نگه داشته شود که از این اجزا میتوان به فیبرینوژن با وزن مولکولی 340000 ، HDL با وزن مولکولی 400000 و ایمونوگلوبولین (IgM) با وزن مولکولی 900000 دالتون اشاره کرد. با توجه به فاکتورهای ریسکی بیماریهای قلبی و عروقی، کاهش فیبرینوژن میتواند مفید باشد اما کاهش کلسترول HDL به عنوان یک فاکتور محافظ در برابر تصلب شرایین میتواند سبب بالا رفتن خطر بیماری شود]15و9[. شکل2 بصورت شماتیک نحوه عملکرد فرآیند فیلتراسیون آبشاری را نشان میدهد.
شکل2- فرآیند جداسازی کلسترول ال دی ال از پلاسمای خون با روش فیلتراسیون آبشاری
از غشاهای تجاری شده برای حذف LDL از پلاسمای خون میتوان به غشای الیاف توخالی(hollow fiber) ساخت شرکت تری ام(3 M) با نام تجاری SelectiCure 19 از جنس پلی اتر سولفون، غشای ارائه شده توسط شرکت فرزنیوس (Fresenius) با نام تجاری Monet از جنس پلی سولفون، غشای تولیدی شرکت مدیکا(Medica) ایتالیا با نام تجاریversatileTM PES و از جنس پلی اترسولفون و غشای ساخت شرکت آساهی( ASAHI KASEI) ژاپن با نام تجاری EC50W از جنس پلیاترسولفون اشاره کرد. مکانیسم جداسازی LDL در این غشاها به روش فیلتراسیون آبشاری است. بعنوان مثال غشای SelectiCure 19 تا حد زیادی قابلیت جداسازی LDL از پلاسما را دارا است، هرچند که این غشا مقدار HDL را نیز تا حدود 50 درصد کاهش میدهد. شکل3 ، نمودار عملکرد این غشا را با معیار قرار دادن کلسترول LDL، HDL، پروتئین آلبومین و ایمونوگلوبولین G (IgG) نشان میدهد]17[.
شکل3- نمودار عملکرد غشای تجاری Selecti Cure H19 ]17[.
غشاهای جاذب LDL بر پایه پلی سولفون
گیرندههای ذاتی LDL (low density lipoprotein receptor) وظیفه جداسازی LDL مازاد از خون را دارا هستند. این گیرندهها دارای ساختار الیگوساکاریدی و اتصالات اکسیژن و نیتروژن است و حاوی لیگاندهای باردار منفی برای برهمکنش با بخشهای مثبت(Apo B100) مولکول LDL است. پلی اتر سولفون و پلی سولفون از پلیمرهای محبوب در ساخت غشا در کاربردهایی نظیر همودیالیز]18[ و تصفیه خون میباشند. اخیرا مطالعاتی بر روی غشاهای جاذب LDL بر اساس غشای صفحهای بر پایه پلیسولفون صورت گرفته است. در این تحقیقات با الهام از ساختار LDLR از روشهای اصلاح متفاوتی برای دستیابی به غشا با قابلیت مورد نظر استفاده شده است. گیرنده LDLR دارای لیگاند اتصال دهنده ای بوده که حاوی 3359 تا 3367 آمینواسید است. این لیگاند از آمینواسیدهایی با بار منفی تشکیل شده که در اثر برهمکنش الکترواستاتیک با Apo B100 که دارای بار مثبت است سبب جذب LDL میشود]15[. ساختار LDLR بصورت شماتیک در شکل 4 نشان داده شده است.
شکل 4 – شماتیک ساختار گیرنده ذاتی LDL ]15[.
از کارهای صورت گرفته در این رابطه میتوان به هپارینه کردن سطح غشای پلیسولفون با روش های مختلف همچون کلرومتیل دار کردن، اصلاح با پلاسمای آمونیاک و اصلاح با پلی دپامین و پلی اتیلین ایمین. گلیکوزیله کردن آنیوتی غشا و استفاده سدیم آلژینات سولفات اشاره کرد. هپارین به عنوان یک پلیساکارید شدیدا سولفاته از مستعدترین مواد برای اصلاح غشا برای کاربرد ذکر شده محسوب میشود]20و19[.
در تحقیقی که توسط Huang و همکاران صورت گرفت با اصلاح سطح غشای تخت پلیسولفون توسط هپارین موفق به جذب بالایی از LDL شدند. برای این منظور غشای پلیسولفون به روش جدایی فازی ساخته شد و سپس عملیات اصلاح بر روی غشا انجام گرفت. به منظور ایجاد اتصال شیمیایی هپارین بر روی غشا، ابتدا کلرومتیل دار کردن غشا صورت پذیرفت و در ادامه توسط غوطه وری در اتیلن دی آمین، گروههای آمینو بر روی سطح غشا متصل گردید. پس از حضور گروههای آمینو سطحی، اتصال هپارین بر روی سطح غشای آمین دار به کمک EDC/NHC انجام گردید و در نهایت غشا با این رویه هپارینه شد]21و8[. شکل 5 بصورت شماتیک فرآیند اصلاح ذکر شده را نشان میدهد]8[. نتایج حاکی از آن بوده که غشاهای هپارینه شده عملکرد مثبتی در جذب LDL و سپس احیای آن داشته اند.
شکل5- نمایش شماتیک اصلاح غشای پلی سولفون]8[.
در پژوهشی دیگر که توسط Li و همکاران صورت پذیرفت اصلاح سطح از طریق تخلیه تابشی در فشار اتمسفری (atmospheric pressure glow discharge(APGD)) انجام شد. در این سامانه از پلاسمای آمونیاک و آرگون، به ترتیب با نسبت 5 به 1 جهت تولید گروههای آمینو بر روی سطح غشای پلی سولفون استفاده شد. همچنین به منظور جلوگیری از تخریب احتمالی غشا، نمونهها فقط به مدت 30 ثانیه در معرض پلاسما قرار داده شد. پس از اصلاح سطح غشا با پلاسمای آمونیاک و تشکیل گروههای آمینو عملیات هپارینه کردن بر روی غشا انجام پذیرفت. شکل6 نمایش شماتیک فرآیند شرح داده شده را نشان میدهد]22[.
شکل6-اصلاح غشای پلی سولفون با پلاسمای آمونیاک]22[.
از روشهایی که برای صحت سنجی اصلاح سطح غشا در تحقیقات استفاده شده است می توان به ATR-FTIR و XPS اشاره کرد، همچنین اندازهگیری زاویه تماس برای بررسی آبدوستی و پتانسیل زتا به منظور ارزیابی بار سطح نمونه بکار گرفته میشود]21-23[. فاکتور دیگری که در غشاهای جاذب LDL مورد اهمیت است بحث احیای غشا از طریق دفع مواد جذب شده به سطح پس از فیلتراسیون میباشد. درواقع پس از عملیات جذب LDL بر روی غشا، غشای مذکور بایستی مجددا احیا شده تا عملکرد غشا در طول انجام فرآیند دستخوش تغییر قرار نگیرد. بنابراین احیاء غشا از اهمیت ویژهای برخوردار بوده که برای این منظور از محلول اوره یا محلول سدیم کلرید غلیظ استفاده میشود. در واقع سدیم کلرید از طریق دخالت در برهمکنش الکترواستاتیک و اوره از طریق شکستن پیوند هیدروژنی بین سطح غشا و مواد جذب شده سبب دفع LDL جذب شده و درنتیجه احیای غشا میشود]24[. در مطالعه دیگر که توسط wang و همکارن انجام گرفت، غشاهای مورد نظر ابتدا از طریق روش جدایش فازی ساخته شدند سپس به منظور اتصال با سدیم آلژینات سولفات تحت فرآیند اصلاح قرار گرفتند به این صورت که ابتدا لایهای آکریل آمیدی به کمک تشعشع UV بر روی سطح غشا متصل شده و سپس به منظور ایجاد گروههای آمینی بر روی سطح از طریق واکنش شیمیایی نوآرایی هافمن گروههای آمیدی به گروههای آمین تبدیل شد و در انتها سدیم آلژینات سولفات از طریق گروههای هیدروکسیل به گروههای آمینی موجود در سطح غشا پیوند زده شد. در این مرحله از گلوتاراآلدهید به عنوان یک اتصال دهنده دو عاملی استفاده شد. سدیم آلژینات سولفات از طریق سولفاته کردن سدیم آلژینات با کلروسولفونیک اسید در فرمامید تهیه گردید. شکل7 نمایش شماتیک فرآیند اصلاح غشای پلی سولفون با سدیم آلژینات سولفات را نشان میدهد]25[.
شکل7- فرآیند اصلاح سطح غشای پلی سولفون با سدیم آلژینات سولفات]25[.
غلظت سنجی LDL هم برای مرحله جذب و هم برای احیاء با روش الایزا(ELISA) صورت گرفته است. این روش، بر اساس چسبندگی آنتی بادی و آنتی ژن بر روی بستر مورد نظر عمل کرده و در انتها از طریق ایجاد تغییر رنگ به کمک واکنشگرهای مخصوص الایزا، نتیجه از طریق دستگاه خوانشگر الایزا که مکانیسم عملکرد آن بر اساس اندازه گیری چگالی نور(optical density) میباشد مشخص میشود. در مورد غشاهای این دسته، علاوه بر توانایی بالا در جذب LDL بایستی سرعت بالایی هم در دفع LDL در فرآیند احیا غشا داشته باشد. در شکل8 نتایج جذب و احیاء غشای پلیسولفون اصلاح شده با سدیم آلژینات سولفات نشان داده شده است]25[. بررسی غلظت LDL در مرحله دفع غشا به مانند مرحله جذب بوده با این تفاوت که قبل از انجام غلظت سنجی، نمونه های غشایی در محلول سدیم کلرید با غظتهای مختلف شستشو داده شدند.
شکل8 – نتایج الف) جذب و ب) دفع LDL بر روی غشاهای اصلاح شده ]25[.
جذب LDL از پلاسمای خون از طریق گلیکوزیله کردن سطح غشای پلی سولفون
Fang و همکاران به منظور گلیکوزیله کردن آنیونی غشای پلی سولفون، در ابتدا از طریق پرتو UV، اکریلیک اسید به سطح غشا اتصال داده شد که به این ترتیب غشا کربوکسیله گردید (PSf-COOH). در ادامه از طریق واکنش غشای کربوکسیله شده مرحله قبل با EDC/NHS ، غشای آمید دار شده (PSf-CCH) حاصل شد. نهایتا با بهره گیری از روش شیمی کلیک، سطح غشای پلیسولفون گلیکوزیله و سولفونه (PSf-GS) گردید. شکل9 بصورت شماتیک نحوه فرآیند اصلاح را نشان می دهد]26[.
شکل9- شماتیک نحوه اصلاح غشای پلی سولفون]26[.
نتایج آزمون XPS و ATR-FTIR صحت فرآیند اصلاح را تایید کرد و همانگونه که از شکل10 –الف و ب مشخص شده است نتایج آزمون XPS به خوبی افزایش درصد میزان گوگرد را برای غشای اصلاح شده با هپارین تایید میکند. همچنین نتایج آزمون ATR-FTIR (شکل10-ج) از ناپدید شدن پیک گروه کربونیل و مشاهده پیک های هیدروکسیل و گروه سولفونه صحت فرآیند اصلاح را تایید میکند. نتیجه آزمون اندازه گیری زاویه تماس بخوبی نشان میدهد که غشای اصلاح شده با هپارین با زوایه تماس آب 19، آبدوستی بسیار بالاتری در مقایسه با غشای پلی سولفون اصلاح نشده دارد(شکل 10-د).
شکل 10- نتایج آزمون غشاهای اصلاح شده الف و ب) نتایج آزمون XPS ، ج) نتیجه آزمون FTIR و د) نتیجه آزمون زاویه تماس]26[.
هپارینه کردن سطح غشای پلی سولفون از طریق رسوب پلی دپامین- پلی اتیلن ایمین
در مطالعه دیگر به منظور هپارینه کردن غشای پلی سولفون، در ابتدا پلی دپامین و پلی اتیلن ایمین در یک محیط بازی ضعیف بر روی سطح غشای پلی سولفون رسوب داده شده و سپس از طریق واکنش آمینوکربونیل، هپارین به سطح غشای پلیسولفون آمین دار شده با استفاده از EDC/NHS متصل گردید. نتایج نشان داد که غشای اصلاح شده با هپارین با این روش دارای زاویه تماس 42 بوده و از آبدوستی بالایی در مقایسه با غشاهای اصلاح نشده پلی سولفون و غشای عامل دار شده با پلی دپامین و پلی اتر ایمین دارد (شکل 11-الف). همچنین نتایج آزمون پتانسیل زتا (شکل 11-ب) مشخص کرد که در pH خنثی، بار الکتریکی غشای پلیسولفون از منفی 50 میلی ولت به 30 میلی ولت پس از اصلاح با پلی دپامین و پلی اتر ایمین تغییر کرد و در ادامه پس از هپارینه کردن غشا، میزان بارالکتریکی به منفی 33 میلی ولت کاهش پیدا کرد که از این طریق صحت فرآیند هپارینه کردن غشای پلی سولفون تایید شد. همچنین در شکل 11 نتایج عملکرد غشا در جذب LDL نشان داده شده است. همانگونه که از شکل 11-ج مشخص شده است، بالاترین میزان جذب LDL مربوط به غشای پلی سولفون هپارینه شده است. همچنین نکته قابل توجه در این مطالعه این بوده است که با افزایش میزان غلظت LDL در خوراک مورد نظر، قابلیت غشای هپارینه شده برای جذب LDL بیشتر بوده است. همچنین عملکرد رقابتی غشا هنگامی که در خوراک مورد نظر از ترکیب LDL و آلبومین انسانی (HSA) استفاده شده مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد اگرچه با افزایش میزان پروتئین آلبومین در خوراک مورد نظر، میزان جذب LDL پایین میآید اما همچنان غشای پلیسولفون هپارینه شده توانمندی جذب LDL بالاتری نبست به غشای پلیسولفون اصلاح نشده دارد(شکل 11-د)]27[.
شکل 11 -نتایج آزمون های الف) آبدوستی ب) پتانسیل زتا ج) جذب LDL در غلظت های متغییر پروتئین آلبومین د) جذب LDL در غلظت های متغییر LDL بر روی غشای پلی سولفون(PSf)، پلی سولفون اصلاح شده با پلی دپامین و پلی اتیلن ایمین (PSf/PDA/PEI)و پلی سولفون هپارینه شده (PSf/Heparin) ]27[.
خون سازگاری غشا
فاکتور دیگری که در جداسازی LDL به کمک فرآیندهای غشایی مورد اهمیت است، بحث خون سازگاری غشای مربوطه است. از آزمونهای خون سازگاری متنوعی از جمله اندازهگیری زمان ترومبین(PT)، زمان نسبی ترومبوپلاستین(PPT)، چسبندگی پلاکت و فعالیت کالیکرئین میتوان اشاره کرد، چسبندگی پلاکت از معمولترین روشها در بررسی خون سازگاری غشا پلیمری محسوب میشود. به عنوان مثال در تحقیق اخیر که اصلاح سطح غشای پلیسولفون به کمک سدیم آلژینات سولفات صورت پذیرفت، بررسی چسبندگی پلاکت توسط SEM مورد ارزیابی قرار گرفت که نتایج آن در شکل12 نشان داده شده است]28[.
شکل 12- نتایج میکروسکپ الکترونی روبشی(SEM) از چسبندگی پلاکت بر روی نمونه های پلی سولفون و پلی سولفون اصلاح شده با آکریلامید و پلی سولفون اصلاح شده با سدیم آلژینات سولفات]28[.
همانطور که در شکل12 مشخص است نمونه پلی سولفون اصلاح نشده بیشترین میزان چسبندگی پلاکت و فعال شدن آن را دارا میباشد و غشای اصلاح شده با سدیم آلژینات سولفات با چسبندگی و فعالیت پلاکت بسیار کمتری مواجه شده است. از بررسی مورفولوژی پلاکتها میتوان به فعالیت آنها پی برد. بطورکلی 5 حالت برای فعال شدن پلاکت در نظر گرفته میشود(شکل13). در بهترین حالت پلاکت در حالت گرد(R) و کروی قرار دارد و فرآیند فعال شدن به ترتیب با شاخه دار شدن (D)، شاخه دار پراکنده(SD)، در حال پخش(S) و پخش کامل(FS) پیش میرود که در بحث خون سازگاری، حالت اخیر بدترین حالت ممکن است که گویای فعال شدن پلاکت و انعقاد خون میباشد]29و3[.
شکل 13- مراحل فعال شدن پلاکت در مسیر انعقاد]29و3[.
نتیجه گیری
با توجه به آمار بالای مرگ و میر ناشی از بیماریهای قلبی و عروقی که عمدتا به دلیل بیماریهای تصلب شرایین و عروق کرونری است که آن هم اغلب به دلیل تجمع لیپوپروتئینهایی از قبیل LDL در جداره عروق میباشد، تلاش در جهت به حداقل رساندن این معظل بزرگ بسیار پر اهمیت است. همانطور که در متن اشاره شد، روشهای جداسازی LDL از خون بر مبنای فیلتراسیون و جذب میباشد. اخیرا فرآیندهای غشایی بر پایه پلیمرهایی چون پلیسولفون و پلی اترسولفون که در بخشهای دیالیز و هموپرفیوژن بکار برده شدند مورد توجه فرآیندهای جداسازی LDL نیز قرار گرفتهاند. در رویکرد جذب، با ساخت غشاهای جاذب از طریق اصلاح سطح غشا، در راستای جداسازی LDL گام برداشته میشود. با توجه به کارا بودن جداسازی LDL بخصوص برای بیمارانی که از هایپرکلسترولمی فامیلی رنج میبرند، توسعه فرآیندهای ساده تر و کاراتر از ضررویات فرآیند جداسازی LDL محسوب میشود.
تشکر و قدردانی
این اثر تحت حمایت مادی صندوق حمایت از پژوهشگران و فناوران کشور (INSF) برگرفته شده از طرح شماره «4001244» انجام شده است.
مراجع
1. Cai A., Li L., Zhang Y., Mo Y., Mai W., and Zhou Y., Lipoprotein (a): A Promising Marker for Residual Cardiovascular Risk Assessment, Diseases Markers, 35, 551-559, 2013.
2. National Institute of Health, http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/blood.html, Available in September 2021.
3. Dehghan R. and Koosha M., Specification of Polyurethane as Prosthetic Heart Valve, Polymerization, 5, 48-60, 2015.
4. Marinetti G.V., Disorders of Lipid Metabolism, New York, Springer Science & Business Media, 89-95, 2012.
5. De Castro-Orós I., Pocoví M., and Civeira F., The Genetic Basis of Familial Hypercholesterolemia: Inheritance, Linkage, and Mutations, The Application of Clinical Genetics, 3, 53-54, 2010.
6. Yang C. Y., Chen S. H., Gianturco S. H., Bradley W. A., Sparrow J. T., Tanimura M., Li W. H., Sparrow D. A., Deloof H., Rosseneu M., and Lee F.S., Sequence, Structure, Receptor-Binding Domains and Internal Repeats of Human Apolipoprotein B-100, Nature, 323, 738-742, 1986.
7. Fox K.M., Gandhi S.K., Bullano M.F., Ohsfeldt R.L., and Davidson M.H., Low-Density Lipoprotein Levels and Dyslipidemia Treatment in Patients Diagnosed with Atherosclerosis, In Circulation, 117, E425-E426, 2008.
8. Huang X.J., Guduru D., Xu Z.K., Vienken J., and Groth T., Immobilization of Heparin on Polysulfone Surface for Selective Adsorption of Low-Density Lipoprotein (LDL), Acta Biomaterialia, 6, 1099-1106, 2010.
9. Duell P.B., Low-Density Lipoprotein (LDL) Apheresis, Dyslipidemias, NewYork, Humana Press, 2015.
10. Hudgins L.C., Gordon B.R., Parker T.S., Saal S.D., Levine D.M., and Rubin A.L., LDL Apheresis: An effective and Safe Treatment for Refractory hypercholesterolemia, Cardiovascular Drug Reviews, 20, 271-280, 2002.
11. Encyclopedia Britannica, Low density lipoprotein physiology, https://www.britannica.com/science/low-density-lipoprotein, available in June 2021.
12. Orlova E.V., Sherman M.B., Chiu W., Mowri H., Smith L.C., and Gotto A.M., Three-Dimensional Structure of Low Density Lipoproteins by Electron Cryomicroscopy, Proceedings of the National Academy of Sciences, 96, 8420-8425, 1999.
13. Moffatt R.J. and Stamford B., Lipid Metabolism and Health. CRC Press, 2005.
14. Camacho P., Clinical Endocrinology and Metabolism, Manson publishing, Maywood illions, USA , 171-173, 2011.
15. Harisa G.I., and Alanazi F.K., Low Density Lipoprotein Bionanoparticles: From Cholesterol Transport to Delivery of Anti-Cancer Drugs, Saudi Pharmaceutical Journal, 22, 504-515, 2014.
16. Bambauer R., Bambauer C., Lehmann B., Latza R., and Schiel R., LDL-Apheresis: Technical and Clinical Aspects, The Scientifc World Journal, 2012.
17. Selecti cure H19 cascade filter, www.membrana.com, available in may 2020.
18. Borberg H., Results of An Open, Longitudinal Multicenter LDL-Apheresis Trial, Transfusion Science, 20, 83–94, 1999.
19. Bambauer R., Schiel R., Latza R., Current Topics on Low-Density Lipoprotein Apheresis Methods. Therapeutic Apheresis, 5, 293–300, 2001.
20. Seidel D., Wieland H., Ein Neues Verfahren zur Selektiven Messung und Extrakorporalen Elimination von Low-Density Lipoproteinen, Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, 20, 684. 1982.
21. Bambauer R., Olbricht C.J., and Schoeppe E., Low-Density Lipoprotein Apheresis for Prevention and Regression of Atherosclerosis: Clinical Results, Therapeutic Apheresis, 1, 242–248, 1997.
22. Bosch T., Lennertz A., Schmidt B., Fink E., Keller C., DALI Apheresis in Hyperlipidemic Patients: Biocompatibility, Efcacy, and Selectivity of Direct Adsorption of Lipoprotein from Whole Blood, Artificial Organs, 24, 81–90, 2000.
23. Barzin J., Feng C., Khulbe K.C., Matsuura T., Madaeni S.S., and Mirzadeh H., Characterization of Polyethersulfone Hemodialysis Membrane by Ultrafiltration and Atomic Force Microscopy, Journal of Membrane Science, 237, 77-85. 2004.
24. Fang F., Zhu X.Y., Chen C., Li.J., Chen D.J., and Huang X.J., Anionic Glycosylated Polysulfone Membranes for the Affinity Adsorption of Low-Density Lipoprotein via Click Reactions, Acta biomaterialia, 49, 379-387, 2017.
25. Wang L., Fang F., Liu Y., Li J., and Huang X., Facile Preparation of Heparinized Polysulfone Membrane Assisted by Polydopamine/Polyethyleneimine Co-deposition for Simultaneous LDL Selectivity and Biocompatibility, Applied Surface Science, 385, 308-317, 2016.
26. Huang X.J., Guduru D., Xu Z.K., Vienken J., and Groth T., Blood Compatibility and Permeability of Heparin‐Modified Polysulfone as Potential Membrane for Simultaneous Hemodialysis and LDL Removal. Macromolecular Bioscience, 11, 131-140, 2011.
27. Li J., Huang X.J., Ji J., Lan P., Vienken J., Groth T., and Xu Z.K., Covalent Heparin Modification of a Polysulfone Flat Sheet Membrane for Selective Removal of Low‐Density Lipoproteins: A simple and versatile method. Macromolecular Bioscience, 11, 1218-1226, 2011.
28. Wang W., Huang X.J., Cao J.D., Lan P., and Wu W., Immobilization of Sodium Alginate Sulfates on Polysulfone Ultrafiltration Membranes for Selective Adsorption of Low-Density Lipoprotein, Acta Biomaterialia, 10, 234-243, 2014.
29. Aksoy E.A., Synthesis and Surface Modification Studies of Biomedical Polyurethanes to Improve Long-term Biocompatibility, Ph.D Thesis, Middle East Technical University, July 2008.
[1] (*) To whom correspondence should be addressed.
E-mail: J.Barzin@ippi.ac.ir
[2] J.Barzin@ippi.ac.irمسئول مکاتبات، پیام نگار: *
